Введение
Колоректальный рак (КРР) занимает четвертое место в мире по смертности, с ежегодной регистрацией более 1 млн новых случаев и ~715 000 летальных исходов [1]. В России за последнее десятилетие заболеваемость КРР возросла на 49.5%, а годичная летальность достигает 40%, что во многом обусловлено поздней диагностикой [2]. Частота метастазирования превышает 50%, а 5-летняя выживаемость без лечения не превышает 2% [1]. Эти данные подчеркивают необходимость поиска новых высокоспецифичных молекулярных маркеров для ранней диагностики и прогноза. Раково-тестикулярные антигены (РТА, Cancer-Testis Antigens - CTA) представляют перспективную группу таких маркеров. Их ключевая особенность – ограниченная экспрессия в норме (преимущественно в зародышевых клетках семенников, плаценте и некоторых нейронах) и реактивация в различных типах злокачественных опухолей [3]. Известно 276 CTA, объединенных в 138 семейств, наиболее изученными из которых являются MAGE-A, MAGE-B, BAGE, GAGE, SSX, LAGE и MAGE-C [4]. Пептиды CTA, презентируемые в комплексе с молекулами HLA I или II класса, способны индуцировать специфический противоопухолевый иммунный ответ [5]. Каждый тип опухоли обладает уникальным профилем экспрессии CTA, что требует детального анализа для их использования в качестве диагностических/прогностических маркеров или мишеней иммунотерапии [6; 7].
Экспрессия CTA при КРР, особенно у пациентов российской популяции, изучена фрагментарно [7; 8]. Первые исследования (1996 г.) показали гиперэкспрессию MAGEA1 (30%), MAGEA2 (28%) и MAGEA3 (20%) у 54 пациентов, причем чаще при наличии метастазов [9]. Это позволяет предположить связь экспрессии генов семейства MAGE с агрессивным фенотипом и метастатическим потенциалом КРР. Однако сравнительный анализ экспрессии CTA в первичных опухолях и метастазах (особенно печеночных) остается недостаточным [10]. Существующие данные указывают на значительный диагностический и прогностический потенциал отдельных представителей CTA при КРР [1].
Цель исследования - провести сравнительный анализ транскрипционных профилей расширенной панели генов РТА в опухолевой ткани пациентов с локализованным (T1-3N0M0) и регионарно-метастатическим (T1-3N1-2M0) КРР для выявления ассоциаций с метастатическим потенциалом.
Материалы и методы исследования
Характеристика пациентов. В исследовании использованы парные образцы (опухоль и гистологически нормальная слизистая оболочка толстой кишки, взятая на расстоянии >10 см от опухоли) от 60 пациентов, проходивших лечение в НМИЦ в 2023-2025 гг. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ; для каждого больного было получено информированное согласие на включение его в данное исследование. Образцы тканей, полученные во время операции, мгновенно замораживали в жидком азоте в криопробирках [6].
Пациенты, вошедшие в исследование, были разделены на 2 группы: группа 1 (n=30): T1-3N1-2M0 (регионарные метастазы), группа 2 (n=30): T1-3N0M0 (без регионарных метастазов).
Выделение РНК и синтез кДНК. Ткани гомогенизировали в буфере с гуанидин тиоцианатом. Тотальную РНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции [11] c использованием станции QIAcube Connect (Qiagen). Контаминацию геномной ДНК удаляли с помощью ДНКазы I [12]. Качество РНК оценивали электрофорезом в 2% агарозном геле (соотношение интенсивностей полос 28S:18S ≈ 2:1). Синтез кДНК проводили с использованием набора Reverta-L («Интерлабсервис») [12].
Анализ экспрессии генов методом RT-qPCR. Анализировали относительную экспрессию 20 РТ-генов (MAGE-A1, -A2, -A3, -A4, -B1, -B2, GAGE-1, -3, -4, MAGE-C1, BAGE, XAGE-3, NY-ESO-1, SSX-2, SCP-1, PRAME-1, CTAG-1B, SPAG-9, PAGE-5, CXorf61) методом RT-qPCR. В качестве референсных генов использовали GAPDH и GUSB. ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси (11 нг кДНК, 0.2 мМ dNTPs, 2.5 мМ MgCl₂, 1х ПЦР-буфер, 2 ед. SynTaq ДНК-полимеразы, краситель EVA-Green, по 435 нМ каждого праймера) на амплификаторе CFX-96 (Bio-Rad). Условия амплификации: 95 °C - 240 с; 40 циклов: 95 °C - 10 с, 58 °C - 30 с, 72 °C - 30 с. Последовательности праймеров представлены в таблице. Расчет относительной экспрессии (RЕ) проводили по методу 2-ΔΔCt [7; 13]: 1) проводилась нормализация по среднему референсных генов: ΔC(t) = C(t)target – C(t)reference; 2) рассчитывали медианы ΔC(t) по каждому гену для условно-нормальной и опухолевой ткани; 3) проводилась нормализация по условно-нормальной ткани: ΔΔC(t) = ΔC(t)Медиана опухолевой ткани – ΔC(t) Медиана нормальнойткани; 4) окончательный результат (кратное различие (Fold difference)): 2-ΔΔC(t)..
Панель праймеров для определения относительной экспрессии генов
|
№ |
Название гена |
Последовательности праймеров (5'->3') |
|
|
Прямой |
Обратный |
||
|
1 |
GAPDH |
GTCAAGGCTGAGAACGGGA |
TCGCCCCACTTGATTTTGG |
|
2 |
GUSB |
CAGGACCTGCGCACAAGA |
CTAGCGTGTCGACCCCATT |
|
3 |
MAGE-A1 |
GAAGGAACCTGATCCAGG |
GGGAATTCTGTCCTCTGGG |
|
4 |
MAGE-A2 |
CGAAGGCTCCGTGAGG |
TGTATTGACCTGAGTCACC |
|
5 |
MAGE-A3 |
TGAGCAAAGAGCGACG |
TCAGACTGTCCCCTCAGA |
|
6 |
MAGE-B1 |
TTCAGTGTGGTGTCCAGCA |
CGAGTTGTACTCCTGGATGATC |
|
7 |
MAGE-B2 |
AGCCAGGGGTGAATTCTCT |
GCACGGAGCTTACTCTCCT |
|
8 |
GAGE-1 |
CTGATGGGCACGAGATGGA |
CCAGTCTCGGCAACATAGTG |
|
9 |
GAGE-3 |
TCACACAGCTGAGTTGGCG |
TGTGTGAAATATGAGTTGGCGC |
|
10 |
GAGE-4 |
GAGGAGGTGAAAACGCCTG |
CATCATTTCAACGTGCCTTCG |
|
11 |
MAGE-C1 |
ACGAGGATCGTCTCAGGTC |
CAGGTCTTCAACTCCTGCC |
|
12 |
MAGE-A4 |
CTGACCAGCAGCTTGGGAT |
TCCAGGGAATCCTGTCCTC |
|
13 |
BAGE |
GCCGGCTCCTTTCAGGATT |
ACATCTTTCAGGAGCTTGGT |
|
14 |
XAGE-3 |
ACTTGCCCTGAGACTTAGT |
CTTGCCCTGAGACTTAGTTT |
|
15 |
NY-ESO-1 |
GAGTTCACTGTGTCCGGCA |
TGGAGACAGGAGCTGATGG |
|
16 |
SSX-2 |
TACGGTTGGTGCTCAAATAC |
CGAGGCTTTCATCTTTTCCT |
|
17 |
SCP-1 |
AGGTGAAACCTCAGACCC |
AGTCTTTGCAAATGGAAACTCAA |
|
18 |
PRAME-1 |
GCTGAGCCATTGTCTCGTTAC |
GGTCTCAGTCACTTGTTGCC |
|
19 |
CTAG-1B |
GCCAGTGACCCAGAGATGAA |
GCACAGGATGTAGGTGGTGA |
|
20 |
SPAG-9 |
AAGCCCAGACCTTTGATGCT |
TGGTTTCGGCTTCAGGTAGT |
|
21 |
PAGE-5 |
CTGGGACTCCTGGGACTCTA |
GGGACAGGTAGCCATTGTGT |
|
22 |
CXorf61(CT83) |
ATGAACTTCTATTTACTCCTAGCGAG |
CTACAATATTGAGTGTGGGAAATTATTTA |
Примечание: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.
Статистический анализ. Сравнение между двумя независимыми группами проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни в среде R (версия 4.5.2). При выполнении множественных сравнений применяли поправку Бонферрони. Различия считали статистически значимыми при скорректированном уровне значимости p<0.05 (padjust bonferroni) [7].
Результаты исследования и их обсуждение
В объединенной выборке, состоящей из 30 пациентов с наличием (T1-3N1-2M0) и 30 пациентов без (T1-3N0M0) регионарных метастазов, обнаружено статистически значимое (р<0,005) увеличение экспрессии РТ-генов SSX-2, SCP-1 и PAGE-5 в 1,6, 2,2 и 5,5 раза в опухолевой ткани относительно нормальной ткани и снижение экспрессии РТ-генов BAGE, MAGE-A2 в 1,5 раза, MAGEB2 в 2,0 раза в опухолевой ткани относительно нормальной ткани толстой кишки (рис. 1). Экспрессия остальных 11 генов (MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-B1, GAGE-1, GAGE-3, GAGE-4, MAGE-C1, MAGE-A4, XAGE-3, NY-ESO-1, CTAG-1B) значимо не отличалась от нормы (р > 0.05) (рис. 1).
Рис. 1. Соотношение экспрессии РТ-генов в опухолевой ткани толстой кишки относительно нормальной (объединенная выборка, n=60)
Составлено авторами по результатам данного исследования.
У больных КРР без регионарных метастазов (T1-3N0M0) обнаружено статистически значимое (р<0,05) увеличение экспрессии РТ-генов SPAG-9, MAGE-B1, SSX-2 и SCP-1 в 1,8, 2,2, 2,2 и 2,7 раза соответственно в опухолевой ткани толстой кишки относительно нормальной, а также снижение экспрессии гена BAGE в 1,9 раза в опухолевой ткани относительно нормальной ткани толстой кишки (рис. 2).
У пациентов с наличием регионарных метастазов (группа T1-3N1-2M0) обнаружено статистически значимое (р<0,05) увеличение экспрессии генов GAGE-1, SCP-1, PAGE-5 и PRAME-1 в 2,5, 9,1, 3,5 и 1,9 раза соответственно в опухолевой ткани толстой кишки относительно нормальной, а также снижение экспрессии генов MAGE-A2, MAGE-B1, MAGE-B2, GAGE-4, CTAG-1B и NY-ESO-1 в 2,7, 3,0, 5,9, 3,1, 2,5 и 3,3 раза соответственно в опухолевой ткани толстой кишки относительно нормальной ткани (рис. 2). Следует отметить, что в группе пациентов с метастазами (T1-3N1-2M0) в опухолевой ткани экспрессия генов GAGE-1, SCP-1 и PAGE-5 в 2,3, 3,4 и 3.0 раза соответственно выше (р<0,01) уровня экспрессии этих генов в группе пациентов без метастазов (T1-3N0M0). При этом в группе пациентов с метастазами экспрессия таких генов, как MAGE-A2, MAGE-B1, MAGE-B2, GAGE-4, NY-ESO-1, CTAG-1B и SSX-2 в опухолевой ткани статистически значимо (р<0,05) ниже в 2,8, 6,7, 5,6, 3,8, 2,6 и 1,9 раза соответственно, чем в группе пациентов без метастазов (рис. 2).
Рис. 2. Уровень транскрипционной активности РТ-генов в опухолевой ткани толстой кишки относительно нормальной у пациентов с регионарными метастазами (n=30) и без (n=30)
Составлено авторами по результатам данного исследования.
Как видно из полученных данных, у пациентов с локализованным и местнораспространенным КРР транскрипционные профили РТА значительно отличаются. На рисунке 3 представлены тепловые карты, отражающие экспрессию РТ-генов индивидуально у каждого пациента в двух сравниваемых группах. Полученные данные позволили выделить несколько кластеров экспрессии РТ-генов: 1) гены ранних стадий и локализованного рака - гиперэкспрессия MAGE-B1, SSX-2, SCP-1, SPAG9 (активны в локализованных опухолях и подавляются при прогрессии, кроме SCP-1); 2) гены, активирующиеся при метастазировании в лимфоузлы - PAGE-5, GAGE-1, PRAME-1 (активируются при метастазировании и участвуют в инвазии и диссеминации); 3) гены, не изменяющие экспрессию при локализованном раке и снижающие её при метастазирования - MAGE-A2, MAGE-B2, GAGE-4, NY-ESO-1 и CTAG-1B.
Рис. 3. Тепловые карты экспрессии РТ-генов у пациентов с метастазами (n=30) и без метастазов (n=30)
Составлено авторами по результатам данного исследования.
Ген SCP-1 (Synaptonemal Complex Protein 1) участвует в мейотической рекомбинации, реэкспрессия в опухолях может нарушать репарацию ДНК, а высокая экспрессия коррелирует с геномной нестабильностью. Так, при РЖ его гиперэкспрессия ассоциирована с микросателлитной нестабильностью (MSI) (r=0.62, p=0.01) [14]. Умеренная активация SPAG-9 в группе без метастазов и подавление в группе с метастазами позволяет рассматривать его как ген, чья экспрессия ассоциирована с менее агрессивным фенотипом КРР. Ген PAGE-5 (Prostate-Associated Gene 5) является новым маркером метастазирования при КРР (повышение и в этом исследовании) и ассоциирован с активацией пути Wnt/β-катенин [15].
Продукт гена SSX-2 принадлежит к семейству высокогомологичных белков точек разрыва синовиальной саркомы X (SSX). Эти белки могут функционировать как репрессоры транскрипции. Они также способны вызывать спонтанный гуморальный и клеточный иммунный ответ у онкологических пациентов и являются потенциально полезными мишенями для иммунотерапии на основе противораковых вакцин. Этот ген, а также члены семейств SSX1 и SSX4, участвуют в транслокациях t(X;18) (p11.2;q11.2), характерных для всех синовиальных сарком. Эта транслокация приводит к слиянию гена транслокации синовиальной саркомы на 18-й хромосоме с одним из генов SSX на X-й хромосоме. Кодируемые гибридные белки, вероятно, ответственны за трансформирующую активность. Альтернативный сплайсинг этого гена приводит к образованию множественных вариантов транскриптов. Семейство SSX, включая SSX2, представляет особый интерес как в контексте КРР, так и других злокачественных заболеваний. Повышенная экспрессия SSX2 в неметастатических опухолях КРР согласуется с данными о его детекции при колоректальном раке с частотой 2,5% [16]. Важно отметить, что SSX2 является классическим раково-тестикулярным антигеном, который индуцирует специфический иммунный ответ при различных опухолях, включая меланому, рак легких и рак мочевого пузыря [17].
Гены MAGEB1/B2 – также классические тестикулярно-ограниченные гены, выступающие как супрессоры метастазирования, снижение экспрессии которых может отражать дедифференцировку опухоли. Так, в данном исследовании экспрессия гена MAGE-B1 была повышена в локализованных опухолях КРР. Гиперэкспрессия этого гена ранее была обнаружена в 60% образцов колоректального рака, но экспрессия практически отсутствовала в нормальных тканях, что подтверждает его потенциал в качестве диагностического маркера [18]. Повышение экспрессии гена GAGE-1, а также снижение экспрессии генов SSX-2, MAGE-B1, MAGE-B2, GAGE-4 и NY-ESO-1 согласуется с данными по их экспрессии при местнораспространенном КРР в других исследованиях [9; 10].
При этом полученные данные о дифференциальной экспрессии РТ-генов при локализованном и местнораспространенном КРР также находят подтверждение в исследованиях других онкологических заболеваний. Так, ген GAGE-1, демонстрирующий повышенную экспрессию при местнораспространенном КРР, ранее был обнаружен в различных опухолях, включая гепатоцеллюлярную карциному и опухоли яичников, что подтверждает его роль в прогрессировании опухолевого процесса [19]. Ген PRAME-1, экспрессия которого также возрастает при метастазировании КРР, проявляет схожие паттерны в ряде злокачественных новообразований. Но при немелкоклеточном раке легких экспрессия PRAME часто снижается [20], а при раке молочной железы его высокая экспрессия ассоциирована с плохим прогнозом [21]. Эти различия подчеркивают тканеспецифичность функций РТ-генов.
Для NY-ESO-1/CTAG-1B характерно значимое подавление в опухолях с метастазами, что указывает на возможную роль в качестве супрессора метастазирования или маркера изменения регуляции РTA при прогрессии заболевания. Ген NY-ESO-1 /CTAG-1B, который по полученным данным продемонстрировал снижение экспрессии в метастатических опухолях КРР, в других исследованиях показал противоположную тенденцию. В частности, при раке молочной железы NY-ESO-1 чаще экспрессируется в метастатических очагах по сравнению с первичными опухолями [22], что указывает на различия в регуляции этих антигенов в зависимости от типа опухоли. В отличие от данных литературы [23; 24] для РТ-генов из семейства MAGE-A в проведенном в НМИЦ онкологии исследовании не обнаружено статистически значимого увеличения транскрипционной активности, что коренными образом отличает КРР от опухолей желудка [25]. Эти данные демонстрируют как общие, так и тканеспецифические паттерны экспрессии РТ-генов при различных злокачественных новообразованиях, что имеет важное значение для разработки персонализированных диагностических и терапевтических стратегий.
Заключение
В результате проведенного исследования выявлены значимые различия в транскрипционных профилях раково-тестикулярных антигенов у пациентов с локализованным и местнораспространенным КРР. Установлено, что гены MAGE-B1, SSX2 и SCP1 характеризуются повышенной экспрессией при локализованном КРР, тогда как гены GAGE1, PRAME1 и PAGE5 ассоциированы с метастатическим потенциалом опухоли. Выявленные паттерны экспрессии позволяют выделить три функциональных кластера РТ-генов: гены ранних стадий опухолевого процесса; гены, активирующиеся при метастазировании в лимфоузлы; гены, снижающие экспрессию при метастазировании. Полученные данные имеют важное клиническое значение, поскольку выявленные молекулярные маркеры могут быть использованы для прогнозирования метастатического потенциала колоректального рака и персонализации подходов к лечению. В частности, ген PAGE5, ассоциированный с активацией пути Wnt/β-катенин, представляет особый интерес как потенциальная терапевтическая мишень. Кроме того, обнаруженные различия в экспрессии РТ-генов открывают перспективы для разработки иммунотерапевтических стратегий, направленных на индукцию специфического противоопухолевого иммунного ответа. Дальнейшие исследования должны быть направлены на верификацию выявленных маркеров в проспективных когортах пациентов, а также на изучение функциональной роли этих генов в патогенезе метастазирования КРР.