Поиск противоопухолевых средств, направленных на выключение ключевых процессов опухолевого патогенеза, остается остро актуальной проблемой фундаментальной и клинической онкологии. Участие EGF-зависимых сигнальных путей в патогенезе целого ряда злокачественных опухолей [1-3] определяет актуальность дальнейшего поиска перспективных противоопухолевых агентов среди соединений пиримидинового ряда, способных блокировать рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) [4-6]. Ранее в экспериментах in vivo было показано противоопухолевое действие нового синтезированного производного пиримидинов – 4-{2-[2-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-винил]-6-метил-4-оксо-5-фенил-4h-пиримидин-1-ил}-бензсульфамида натриевой соли (6MPSVаn-Na) – представляющего собой блокатор внутреннего домена EGFR, синтезированный на основе пиримидин-4-она [7].
Вследствие многообразия биологических эффектов производных пиримидина представляется целесообразным учитывать их действие на системные регуляторные процессы, способные оказывать влияние на состояние организма и его устойчивость к опухолевому росту [8; 9]. Таким образом, возникает вопрос о комплексной оценке эффектов нового блокатора EGFR на рост экспериментальных опухолей и системные показатели животных-опухоленосителей, в том числе на показатели общего метаболизма, характеризующие энергетические ресурсы организма, имеющие важное значение для обеспечения его устойчивости к действию повреждающих факторов. Настоящее исследование имеет пилотный характер.
Цель исследования – комплексная оценка показателей, характеризующих активность опухолевого процесса, выраженность противоопухолевого действия и общий метаболизм у половозрелых мышей-самок линии С57Bl/6 с перевивной меланомой В16/F10, получавших гефитиниб и новый блокатор EGFR 6MPSVаn-Na.
Материал и методы исследования
Исследование проводили в зимне-весенний период на 26 половозрелых мышах-самках линии C57Bl/6 весом 18-24 г, полученных в ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» (филиал «Андреевка», Московская область). Животные находились в условиях естественного освещения при свободном доступе к воде и пище. Эксперимент проводили с соблюдением международных правил обращения с экспериментальными животными [10] после положительного решения комиссии по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России (протокол 2/220 от 14.03.2024 г.). Исследованные мыши-самки случайным образом были разделены на 3 группы – контрольную, основную и группу сравнения – каждая из которых включала 8-10 особей. Всем животным по общепринятой методике была трансплантирована перевивная меланома В16/F10 (штамм получен в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, г. Москва) путем введения в правую подлопаточную область 0,5 мл взвеси опухолевых клеток в физиологическом растворе при разведении 1:10.
Через 2 часа после трансплантации опухоли животные получали блокаторы EGFR. Мышам-самкам основной группы 6MPSVаn-Na вводили внутримышечно в разовой дозе 18,75 мг/кг, растворенной ex tempore в 0,3 мл воды для инъекций. У животных группы сравнения гефитиниб использовали в таблетированной форме, применяемой в клинике. Его растворяли водой и вводили per os в разовой дозе 43,9 мг/кг. Животным контрольной группы внутримышечно вводили воду для инъекций в объеме 0,3 мл. Исследованные блокаторы EGFR животные основной группы и группы сравнения получали один раз в день в течение 10 дней.
В ходе исследования ежедневно измеряли объем опухоли, рассчитывавшийся по формуле для эллипсоидов. Также определяли латентный период развития меланомы В16/F10 (время от трансплантации до выхода опухоли), продолжительность жизни (ПЖ) животных с момента трансплантации опухоли, количество и локализацию макрометастазов. С помощью системы «Мониторинг метаболизма ММ-100» и ПО «ММСоm» (USA) методом непрямой калориметрии изучали показатели интенсивности метаболизма на этапах эксперимента – изменения среднего потребления кислорода (VO2, мл/ч), среднего объема произведенного углекислого газа (VCO2, мл/ч), скорректированные относительно массы тела животного, с определением метаболического коэффициента (МК=VCO2/VO2) и показателя интенсивности теплопродукции (ИТ, ккал/кг/ч). Определение показателей проводили путем трех последовательных измерений продолжительностью 3 мин. каждое. Индивидуальный вариационный ряд включал 63-73 значения. При статистическом анализе подсчитывали значения показателей по каждой исследованной группе животных в целом, без определения индивидуальных показателей. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 12. Для оценки межгрупповых различий изученных показателей использовали критерии Стьюдента (при наличии нормального распределения согласно критерию Шапиро – Уилка) для зависимых и независимых выборок, Манна - Уитни и Пирсона (χ2). Определяли коэффициент корреляции Спирмена. Наряду со значениями Q1 и Q3 определяли размах вариаций (xmin-xmax) для оценки степени совпадения диапазонов значений показателей в разных группах [11]. Время наблюдения за животными составило 200 суток со дня трансплантации опухоли.
Результаты исследования и их обсуждение
Показатели, характеризующие опухолевый процесс и устойчивость организма линейных мышей к опухолевому росту, представлены в таблице 1. В контрольной группе выход меланомы был отмечен у всех мышей-самок через 4-8 дней после трансплантации. В группе сравнения действие гефитиниба предотвратило развитие опухоли у половины животных и существенно замедлило ее выход у остальных мышей так, что минимальный латентный период (ЛП) роста меланомы у этих животных в два раза превысил максимальный показатель в контрольной группе. В основной группе опухоль не развилась у одной крысы (10%), а у остальных животных введение 6MPSVаn-Na заметно замедлило ее выход, хотя и в меньшей степени, чем в группе сравнения – минимальный ЛП в основной группе в 1,4 раза превысил максимальный ЛП в контрольной группе, а максимальный ЛП был выше аналогичного показателя в контрольной группе в два раза, то есть таким, как минимальный ЛП в группе сравнения – 16 суток (табл. 1). Животные, у которых не было отмечено развитие опухоли, находились под наблюдением 200 суток со дня трансплантации меланомы В16/F10. Случаи наиболее быстрого роста опухоли наблюдались в контрольной группе. Так, у двух из 8 животных на 18-е сутки после трансплантации объем меланомы составил 2,35 и 2,90 см3, тогда как при введении 6MPSVаn-Na максимальный размер опухоли не превышал 1,7 см3, а в группе сравнения этот показатель составил 0,4 см3.
Таблица 1
Показатели, характеризующие развитие опухоли и влияние исследованных блокаторов EGFR, у половозрелых мышей-самок линии C57Bl/6 с перевивной меланомой B16/F10
|
Показатели /группы |
Выход опухоли, % животных |
ЛП, Me [xmin-xmax], сутки |
Vкон., Me [xmin-xmax], см3 |
ПЖ мышей с Vкон. <1 cм3, cутки |
ПЖ мышей с Vкон. ≥1.7 cм3, сутки |
% мышей с Vкон. <1 cм3 |
Доля мышей с опухолью, с ПЖ более 37cуток, % |
|
Контрольная группа, n=8 |
100 |
6 [4-8] |
3.8 [0.6-4.75] |
29 |
21-40 |
12.5 |
12.5 |
|
Группа сравнения (гефитиниб), n=8 |
50 p1=0,021 |
17 [16-19] p1 <0,05 |
2,6 [0.25 – 13] |
26, 30 |
31, 37 |
50 p1=0,1 |
0 |
|
Основная группа (6MPSVаn-Na), n=10 |
90 p2=0,06 |
11 [9-16] p1 <0,01 |
7.7 [0.42-16.2] |
23, 27 |
39-47 |
22 |
67 p1=0,024 p2=0,027 |
Примечание: уровень статистической значимости отличий от показателя в контрольной группе - р1, от показателя в группе сравнения – р2. Критерий Манна - Уитни, критерий согласия Пирсона (χ2). Таблица составлена авторами на основе данных, полученных в ходе исследования.
В каждой из групп ПЖ и размеры опухоли перед гибелью животных (Vкон.) мышей-опухоленосителей изменялись в широком диапазоне значений (табл. 1). При этом были отмечены характерные особенности влияния исследованных блокаторов EGFR на опухолевый процесс и состояние животных. Во всех группах наблюдались животные, у которых Vкон. был менее 1 см3. При этом имела место тенденция к увеличению доли таких случаев в группе мышей, получавших гефитиниб, по сравнению с контрольной группой (табл. 1). В группах животных, где использовали блокаторы EGFR, наблюдалась корреляция между ПЖ и Vкон. (коэффициент Спирмена превышал +0.600), соответствовавшая заметной тесноте связи по шкале Чеддока. В контрольной группе, в отличие от двух других групп, связь между ПЖ и Vкон. практически отсутствовала – коэффициент Спирмена составил всего +0.045. Основная группа отличалась наиболее значительной ПЖ животных с активно растущими первичными опухолями. Две трети мышей-опухоленосителей, получавших 6MPSVаn-Na, прожили дольше (39-47 суток), чем животные из группы сравнения с активно растущей опухолью, имевшие максимальную ПЖ в группе (37 суток, табл. 1).
При некропсии павших животных разных групп макрометастазы меланомы В16/F10 наблюдали в 50-52% случаях, главным образом в легких и лимфатических узлах, преимущественно в паховых и подмышечных. При этом в группе сравнения макрометастазы в легкие отмечены не были. В основной группе макрометастазы наблюдались только у мышей, проживших не менее 39 дней со дня трансплантации опухоли. Вопрос о наличии микрометастазов специально не изучали, поэтому данные о числе и локализации макрометастазов имели ограниченную информативность. В то же время сведения о более значительной ПЖ мышей основной группы и более позднем появлении у них макрометастазов в совокупности с приведенными выше результатами корреляционного анализа позволяют связать увеличение ПЖ с менее активным метастазированием, чем у животных группы сравнения. Мыши из группы сравнения с неразвившимися опухолями оставались живы в течение всего срока наблюдения (200 суток) без признаков опухолевого роста.
Вызывал интерес вопрос об изменении метаболических процессов при росте меланомы В16/F10 и действии разных пиримидиновых блокаторов EGFR. Описанная выше процедура подсчета групповых показателей в силу обработки значительных по составу вариационных рядов обусловливала низкие величины ошибки среднего, что обеспечивало статистическую значимость даже при небольших различиях в величине показателей с р <0,01-0,001. Сведения о показателях основного метаболизма животных изученных групп представлены в таблице 2. Как видно из таблицы, с первых этапов эксперимента наблюдались четкие межгрупповые различия в динамике исследованных показателей. Так, у животных контрольной группы через сутки после перевивки меланомы В16/F10 было отмечено небольшое повышение потребления кислорода (VO2), на 6%, и выделения углекислого газа (VCO2), на 13%, с ростом метаболического коэффициента (МК) и индекса теплопродукции (ИТ) – на 5 и 20% соответственно. Через неделю после трансплантации показатели снижались до значений, близких к исходным, а спустя еще неделю происходило более заметное и одинаковое снижение VO2 и VCO2 в 1,35 раза по сравнению с исходными значениями, с уменьшением ИТ в 1,25 раза. Дальнейшее, незначительное, снижение исследованных показателей по сравнению с отмеченным на данном этапе (14 дней роста опухоли) наблюдалось спустя 3 недели после трансплантации меланомы В16/F10. Таким образом, к этому сроку, то есть к моменту первого случая гибели животных в контрольной группе, исследованные показатели основного метаболизма были снижены по сравнению с исходными значениями на 12-53% при уменьшении ИТ в 1,33 раза (табл. 2).
Таблица 2
Показатели метаболизма у мышей-самок C57BL/6 с перевивной меланомой В16/F10, получавших различные блокаторы EGFR [M±m, Me; (Q1; Q3)]
|
Показатели / сутки после транплантации опухоли |
Контрольная группа |
Группа сравнения (гефитиниб) |
Основная группа (6MPSVаn-Na) |
|||||||||
|
VO2, мл/мин. |
VСО2, мл/мин. |
Метаболический коэффициент (МК) |
Индекс теплопродукции (ИТ) |
VO2, мл/мин. |
VСО2, мл/мин. |
Метаболический коэффициент (МК) |
Индекс теплопродукции (ИТ) |
VO2, мл/ч, мл/мин. |
VСО2, мл/мин. |
Метаболический коэффициент (МК) |
Индекс теплопродукции (ИТ) |
|
|
До трансплантации |
1,59±0,01 1,60 (1,50; 1,68) |
0,87±0,007 0,86 (0,84;0,90) |
0,55±0,002 0,55 (0,53; 0,58) |
0,02±2х10-4 0,021 (0,018; 0,023) |
1,58±0,02 1,57 (1,47; 1,65) |
0,90±0,01 0,92 (0,84;0,98) |
0,57±0,004 0,56 (0,55;0,59) |
0,024±4х10-4 0,026 (0,020; 0,027) |
1,59±0,02 1,64 (1,47;1,79) |
0,85±0,01 0,86 (0,82;0,91) |
0,55±0,001 0,55 (0,51;0,56) |
0,021±4х10-4 0,023 (0,019; 0,025) |
|
1-е сутки |
1,69±0,009 1 1,69 (1,62; 1,75)↑ |
0,98±0,005 1 0,99 (0.95;1,02)↑ |
0,58±0,003 1 0,53 (0,49; 0,64)↑ |
0,024±10- 1 0,024 (0,023; 0,026)↑ <0,001 |
1,40±0,015 1;2 1,40 (1,36; 1,47)↓ |
0,71±0,007 1;2 0,7 (0,65;0,76)↓ |
0,50±0,003 1;2 0,50 (0,49;0,51)↓ |
0,018±3х10-4 1;2 0,018 (0,016; 0,020)↓ |
1,27±0,009 1;2;3 1,29 (1,18;1,36)↓ |
0,68±0,006 1 0,6 (0,63;0,74)↓ |
0,52±0,001 1;2;3 0,52 (0,51;0,54)↓ |
0,016±2х10-4 1;2 0,017 (0,014; 0,019)↓ |
|
7-е сутки |
1,53±0,015 1 1,57 (1,48; 1,66) |
0,81±0,00 1 0,83 (0,77;0,84) |
0,53±0,003 1 0,53 (0,51; 0,56) |
0,02±2х10-4
0,021 (0,019; 0,023) |
1,26±0,009 1;2 1,26 (1,17; 1,36)↓ |
0,69±0,004 1:2 0,7 (0,66;0,73)↓ |
0,55±0,003 1;2 0,54 (0,53;0,58)↓ |
0,018±2х10-4 1;2 0,018 (0,015; 0,019)↓ |
1,20±0,017 1;2;3 1,24 (1,04;1,36)↓ |
0,53±0,0 1;2;3 0,54 (0,44;0,66) |
0,49±0,002 1;2;3 0,49 (0,47;0,51) |
0,015±3х10-4 1;2;3 0,016 (0,012; 0,016)↓ |
|
14-е сутки |
1,18±0,024 1 1,22 (0,98; 1,41)↓ |
0,64±0,014 1 0,68 (0,54;0,72)↓ |
0,53±0,003 1 0,54 (0,52; 0,56)↓ |
0,016±2х10-4 1 0,017 (0,013; 0,020)↓ |
1,25±0,007 1;2 1,20 (1,17; 1,32) |
0,68±0,004 1;2 0,68 (0,63;0,72) |
0,54±0,002 1 0,54 (0,52;0,53) |
0,017±2х10-4 1 0,016 (0,015; 0,018)↓ |
1,56±0,011 1;2;3 1,59 (1,49;1,64) |
0,75±0,004 1;2;3 0,76 (0,72;0,79) |
0,48±0,002 1;2;3 0,48 (0,48;0,51) |
0,021±2х10-4 2;3 0,021 (0,018; 0,023) |
|
21-е сутки |
1,15±0,021 1 1,17 (0,84;1,39) |
0,57±0,011 1 0,56 (0,43;0,69) |
0,49±0,002 1 0,49 (0,48; 0,52) |
0,015±2х10-4 1, 2 0,015 (0,011; 0,016) |
1,43±0,01 1;2 1,43 (1,36;1,51) |
0,71±0,005 1;2 0,70 (0,68;0,74)↓ |
0,49±0,002 1 0,49 (0,48;0,50) |
0,018±2х10-4 1;2 0,018 (0,017; 0,02)↓ |
1,50±0,01 1;3 1,51 (1,39; 1,59) |
0,78±0,006 1; 3 0,79 (0,73;0,82) |
0,51±0,002 2;3 0,52 (0,50;0,53) |
0,017±10-4 1;2 0,017 (0,016; 0,019) |
Примечание. Отличается от исходных показателей (до трансплантации опухоли) – 1, от показателей в контрольной группе – 2, от показателей в группе сравнения – 3; р1,2,3 <0.01-0.001. Критерий Стьюдента (для зависимых и независимых выборок), критерий Манна - Уитни. Таблица составлена авторами на основе данных, полученных в ходе исследования.
Иная динамика исследованных показателей метаболизма наблюдалась у животных, получавших блокаторы EGFR. Противоположно отмеченному для мышей контрольной группы, спустя сутки после трансплантации опухоли у этих животных имело место не повышение, а снижение показателей – на 6-33% по сравнению с исходными значениями. Спустя неделю после трансплантации опухоли было отмечено еще некоторое снижение показателей, а спустя 3 недели – в отличие от имевшего место в контрольной группе дальнейшего снижения, наблюдалось повышение VO2 и VCO2 на 4-47% по сравнению с минимальными значениями в той же группе на этапах эксперимента. При этом VO2 и VCO2 в обеих группах остались все же ниже исходных значений (табл. 2).
Имелись заметные отличия животных основной группы от мышей-опухоленосителей группы сравнения. Введение 6MPSVаn-Na вызывало более значительное, чем гефитиниб, снижение VO2, VCO2 и ИТ через сутки после трансплантации опухоли (на 10, 4 и 12.5% соответственно). При этом подъем значений показателей в основной группе (в первую очередь, VO2 и VCO2) происходил на неделю раньше, чем в группе сравнения (14 суток после трансплантации опухоли против 21 суток), и был более выраженным (13-47% против 4-25%) (табл. 2). Таким образом, начиная с 14 суток после перевивки меланомы В16/F10, у животных, получавших 6MPSVаn-Na, VO2 и VCO2 были выше, чем у мышей-опухоленосителей, которым вводили гефитиниб, на 5-25%. При этом на 14-е сутки в основной группе МК был сдвинут в сторону кислорода на 12% и увеличен ИТ на 23% относительно показателей группы сравнения, а на 21-е сутки наблюдалось выравнивание этих показателей (табл. 2).
Сведения о весьма заметном увеличении содержания EGFR при росте меланомы В16/F10 в экспериментах in vivo [12] позволяют рассматривать данную опухоль в качестве подходящей экспериментальной модели при изучении эффектов блокаторов данного рецептора. При изучении динамики роста меланомы В16/F10 и продолжительности жизни у мышей-самок линии С57Bl/6 исследованных групп были отмечены различия во влиянии гефитиниба и нового блокатора EGFR 6MPSVаn-Na на развитие опухолевого процесса. Действие гефитиниба выразилось в полном предотвращении роста опухоли у 50% животных. В то же время в случаях формирования меланомы В16/F10 действие этого препарата не привело к увеличению продолжительности жизни таких животных, что, наряду со случаями гибели мышей с объемом опухолей менее 1 см3 и наличием заметной положительной корреляции между ПЖ и Vкон., могло свидетельствовать о неэффективности гефитиниба в отношении метастазирования данной опухоли. Действие 6MPSVаn-Na как профилактического фактора было заметно слабее, чем гефитиниба, однако, в отличие от последнего, оно способствовало увеличению продолжительности жизни у большей части животных с развившимися опухолями, без снижения размеров первичного очага, что могло указывать на антиметастатический потенциал данного соединения.
По мнению авторов, особенности динамики показателей основного метаболизма исследованных животных в определенной мере соответствовали предложенной интерпретации влияния гефитиниба и 6MPSVаn-Na на развитие меланомы В16/F10. При этом снижение интенсивности основного обмена через сутки после трансплантации опухоли у животных обеих групп могло быть обусловлено седативным и анксиолитическим действием, характерным для производных пиримидина [7; 8]. Меньшая выраженность таких эффектов в случае гефитиниба могла быть более благоприятной для процессов противоположной направленности, в частности для активизации нейроиммуноэндокринных механизмов неспецифической противоопухолевой резистентности [13; 14], обусловивших условия, воспрепятствовавшие опухолевому росту у половины животных. Заметный сдвиг в сторону потребления кислорода под влиянием 6MPSVаn-Na и статистически значимое увеличение ИТ по сравнению с отмеченным в группе сравнения через 14 суток после перевивки опухоли указывали на более значительную выраженность процессов аэробного дыхания у животных основной группы на данном этапе, что могло создать критически менее благоприятные условия для метастазирования по сравнению с теми, которые сформировались у мышей, получавших гефитиниб [15; 16].
Ограничение исследования – небольшое число животных, разные способы введения гефитиниба и 6MPSVаn-Na.
Заключение
Результаты пилотного исследования позволяют сделать предварительное заключение об отличиях в характере противоопухолевого влияния нового блокатора EGFR 6MPSVаn-Na от действия гефитиниба и определить направления дальнейших исследований с акцентом на изучение возможного антиметастатического потенциала данного фактора.