Введение
Среди патологий щитовидной железы чаще всего встречается гипотиреоз [1-3]. Клинические проявления данного заболевания сопровождаются в том числе и неврологической симптоматикой [4-6]. Антиоксиданты-цитопротекторы корректируют окислительный стресс, дисфункцию нейротрансмиттеров, улучшают энергетический метаболизм нервных клеток и могут быть использованы в комплексной терапии гипотиреоза. При этом они оказывают выраженное влияние на тиреоидный статус при экспериментальном гипотиреозе [7]. Самую высокую активность связывания свободных радикалов в ряду полярных соединений проявляет феруловая кислота. Патофизиологические механизмы влияния антиоксидантной терапии на поведение крыс при экспериментальном гипотиреозе можно выявить на доклиническом этапе по методике «Открытое поле» [8].
Цель исследования: изучить влияние феруловой кислоты на поведенческую активность крыс-самцов в условиях экспериментального гипотиреоза, индуцированного мерказолилом.
Материалы и методы исследования
В работе использовали половозрелых самцов крыс линии Wistar в возрасте 10-12 недель массой 180-220 г, полученных из вивария Пятигорского медико-фармацевтического института – Филиала Волгоградского государственного медицинского университета. Перед началом эксперимента животные проходили 14-дневный карантинный период. Животные содержались в стандартных условиях вивария при температуре 22±2 °C, относительной влажности 60±5%, 12-часовом световом цикле. Крыс размещали в макролоновых клетках по 5 особей со свободным доступом к воде и корму. Этические принципы:исследование проводили в соответствии с принципами «трех R» (Replacement, Reduction, Refinement), положениями Хельсинкской декларации ВМА (2000), рекомендациями UFAW по гуманной экспериментальной технике. Для постановки эксперимента 40 животных разделяли на 4 группы (n=10 в каждой): интактная группа (биологический контроль), контрольная группа (модель гипотиреоза), опытная группа (гипотиреоз + феруловая кислота), группа сравнения (гипотиреоз + этилметилгидроксипиридина сукцинат) (табл. 1).
Таблица 1
Дизайн исследования
|
Номер группы |
Доза активного вещества |
|
1 - интактные (n=10) |
0 |
|
2 - контроль (n=10) |
тиамазол 5 мг/100 г |
|
3 - опыт (тиамазол + феруловая кислота) (n=10) |
тиамазол 5 мг/100 г + феруловая кислота 100 мг/кг |
|
4 - сравнение (тиамазол + этилметилгидроксипиридина сукцинат) (n=10) |
тиамазол 5 мг/100 г + этилметилгидроксипиридина сукцинат 100 мг/кг |
Источник: составлено авторами.
Для индукции гипотиреоза применяли пероральное введение тиамазола («Мерк Хелскеа КГаА», Германия, серия 208124) в дозе 5 мг/100 г в течение 21 дня. Данная доза была выбрана, учитывая литературные данные, как доза, вызывающая развитие тиреоидной дисфункции и не приводящая к полиорганной недостаточности токсического генеза [9]. В предыдущем исследовании авторами данной работы было отмечено статистически значимое увеличение ТТГ (на 113%) и снижение сТ4 (на 25%) в контрольной группе животных, получавших тиамазол в дозе 5 мг/100 г, относительно интактных крыс [10]. Феруловую кислоту (Greenutra Resource inc, GNR 23082502, годен до 24.08.2026 г.) вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг в течение 21 дня одновременно с введением тиамазола. Доза феруловой кислоты для достижения терапевтического эффекта определялась в предварительных исследованиях на других моделях эндокринных патологий [11]. Этилметилгидроксипиридина сукцинат (ООО «Фармасофт», серия 090624, годен до 06.2027 г.) - препарат сравнения с доказанным антиоксидантным действием [12-14] - вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг в течение 21 дня одновременно с введением тиамазола. Дозы препарата сравнения были подобраны на основании предварительных исследований и пересчета с учетом видовых различий. Неврологические изменения оценивали с помощью теста «Открытое поле» на 7, 14 и 21-е сутки эксперимента [15]. Анализировали показатели эмоционального напряжения: кратковременный груминг, время замирания в центре, количество мочеиспусканий, количество дефекаций и показатели двигательной активности: число стоек, количество пересеченных квадратов, исследовательская активность (заглядывания в норки). Для стандартной оценки тревожности и двигательной активности у крыс использовали5-минутный протокол теста «Открытое поле». Полученные данные анализировали с использованием пакета Statistica 10. Для сравнения групп использовали непараметрический критерий Манна - Уитни (n<15). Различия считали статистически значимыми при p <0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Тест «Открытое поле» является ценным инструментом доклинических исследований, так как его поведенческие выходы (активность в центре, общее движение) являются конечным проявлением сложногопатофизиологического каскада, включающего: восприятие стресса(сенсорные системы), эмоциональную оценку(миндалина, гиппокамп, префронтальная кора), нейрохимическую модуляцию(дофамин, серотонин, ГАМК, глутамат), нейроэндокринный ответ(ось HPA). В предварительном эксперименте было изучено влияние феруловой кислоты (в качестве действующего вещества) на биохимические показатели крови крыс в условиях экспериментального гипотиреоза [10]. Полученные данные позволили считать перспективным дальнейшее изучение влияния феруловой кислоты на изменения, возникающие при гипофункции щитовидной железы.
Таблица 2
Влияние феруловой кислоты на поведенческую активность животных с модельным гипотиреозом на 7-й день эксперимента (медиана Me; нижний и верхний квартили [Q1; Q2])
|
Показатели |
1-я группа (n=10) |
2-я группа (n=10) |
3-я группа (n=10) |
4-я группа (n=10) |
|
|
Число стоек |
3 [1,5; 5,5] |
12,5 [7,0; 18,0] p1<0,05 |
2 [1,5; 3,5] p2<0,05; p3>0,05 |
2,5 [1,0; 4,0] p2<0,05 |
|
|
Число норок |
4 [3,5; 5,5] |
2,0 [2,0; 4,0] p1>0,05 |
1,5 [0,0; 1,5] p1<0,05; p2,3>0,05 |
3 [2,0; 4,0] p1>0,05; p2>0,05 |
|
|
Число пересеченных квадратов |
45 [26,0; 60,5] |
72 [56,0; 94,5] p1<0,05 |
34 [30,5; 39,0] p1>0,05; p2<0,05 p3>0,05 |
23,5 [17,0; 30,0] p1<0,05; p2<0,05 |
|
|
Груминг (короткий) |
15 [9,5; 22,0] |
14 [8,5; 20,5] p1>0,05 |
1,5 [1,0; 3,5] p1<0,05; p2<0,05 p3>0,05 |
2,5 [1,5; 4,0] p1<0,05; p2<0,05 |
|
|
Время замирания в центре |
0 [0,0; 0,0] |
2 [0,0; 3,0] p1<0,05 |
0 [0,0; 1,5] p1>0,05; p2,3>0,05 |
0 [0,0; 0,0] p1>0,05; p2<0,05 |
|
|
Уринации |
0 [0,0; 1,5] |
0,5 [0,0; 1,0] p1>0,05 |
1,0 [1,0; 1,0] p1>0,05; p2,3>0,05 |
1,0 [0,5; 1,5] p1>0,05; p2>0,05 |
|
|
Число болюсов |
3 [1,0; 4,5] |
4,5 [3,5; 6,5] p1>0,05 |
3,5 [1,5; 4,5] p1>0,05; p2,3>0,05 |
4,5 [2,5; 5,0] p1>0,05; p2>0,05 |
|
|
р1 – уровень статистической значимости по отношению к интактным животным; р2 – уровень статистической значимости по отношению к группе контроля; р3 - уровень статистической значимости отличий показаний 3-й группы от 4-й. |
|||||
Источник: составлено авторами.
К концу 1-й недели эксперимента в контрольной группе зафиксировали статистически значимое увеличение относительно интактных животных числа стоек на 316%, числа пересеченных квадратов на 60%. Временя замирания в центре на 2 единицы выше, чем в 1-й группе. Эти данные свидетельствовали о повышении двигательной и эмоциональной активности животных в первую неделю генерирования модели гипотиреоза. В опытной группе и группе сравнения статистически значимых изменений относительно интактной группы не зафиксировано. Использование феруловой кислоты и этилметилгидроксипиридина сукцината способствует сохранению стабильности поведенческой активности показателей в тесте «Открытое поле» на уровне интактной группы. Статистически значимых отличий в опытной группе и в группе препарата сравнения по исследуемым показателям неврологического статуса на 7-й день моделирования гипотиреоза отмечено не было (табл. 2).
Таблица 3
Влияние феруловой кислоты на поведенческую активность животных с модельным гипотиреозом на 14-й день эксперимента (медиана Me; нижний и верхний квартили [Q1; Q2])
|
Показатели |
1-я группа (n=10) |
2-я группа (n=10) |
3-я группа (n=10) |
4-я группа (n=10) |
|
|
Число стоек |
2 [0,5; 3,5] |
2 [0,5; 3,5] p1>0,05 |
3,5 [1,0; 5,0] p1>0,05; p2,3>0,05 |
4 [2,5; 4,5] p1>0,05; p2>0,05 |
|
|
Число норок |
2,5 [1,5; 4,0] |
1 [0,0; 2,5] p1<0,05 |
1 [0,5; 2,5] p1<0,05; p2,3>0,05 |
1 [0,0; 3,0] p1>0,05; p2>0,05 |
|
|
Число пересеченных квадратов |
31,5 [24,0; 45,5] |
13,5 [11,5; 21,0] p1<0,05 |
26,5 [16,5; 32,5] p1>0,05; p2,3>0,05 |
33 [22,5; 45,0] p1>0,05; p2>0,05 |
|
|
Груминг (короткий) |
7 [4,5; 8,0] |
1 [0,0; 2,5] p1<0,05 |
1,5 [0,0; 3,5] p1<0,05; p2,3>0,05 |
1 [1,0; 1,5] p1<0,05; p2>0,05 |
|
|
Время замирания в центре |
0 [0,0; 1,5] |
0 [0,0; 0,5]
|
0 [0,0; 1,0]
|
0 [0,0; 0,5]
|
|
|
Уринации |
1 [0,5; 1,0] |
1 [0,0; 1,0] p1>0,05 |
1 [0,0; 1,0] p1>0,05; p2,3>0,05 |
1 [1; 1] p1>0,05; p2>0,05 |
|
|
Число болюсов |
4,5 [3,5; 6,5] |
5,5 [4,0; 6,5] p1>0,05
|
4,5 [3,0; 6,0] p1>0,05; p2,3>0,05 |
3,5 [1,0; 4,5] p1>0,05; p2>0,05 |
Источник: составлено авторами.
На 14-й день эксперимента в тесте «Открытое поле» зафиксировали статистически значимое снижение короткого груминга на 86% у животных контрольной группы в сравнении с интактными, что свидетельствовало об уменьшении эмоционального напряжения крыс по мере снижения функции щитовидной железы. Также не наблюдалось увеличения двигательной активности животных с гипотиреозом, имевшего место в начале эксперимента, так как число стоек и число пересеченных квадратов не имели статистически значимых отличий от показателей в интактной группе. Терапевтическое применение феруловой кислоты и препарата сравнения этилметилгидроксипиридина сукцината не привело к статистически значимым изменениям показателей поведенческой активности крыс в тесте «Открытое поле» относительно интактной и контрольной групп. Статистически значимых отличий в опытной группе и в группе препарата сравнения по исследуемым показателям поведенческой активности на 14-й день моделирования гипотиреоза не зафиксировано (табл. 3).
Таблица 4
Влияние феруловой кислоты на поведенческую активность животных с модельным гипотиреозом на 21-й день эксперимента (медиана Me; нижний и верхний квартили [Q1; Q2])
|
Показатели |
1-я группа (n=10) |
2-я группа (n=10) |
3-я группа (n=10) |
4-я группа (n=10) |
|
|
Число стоек |
2,5 [1,0; 3,5] |
0,5 [0,0; 1,5] p1<0,05 |
3,5 [2,5; 6,0] p1>0,05; p2<0,05 p3>0,05 |
4 [2,5; 4,5] p1>0,05; p2<0,05 |
|
|
Число норок |
1,5 [0,5; 2,5] |
0 [0,0; 1,0]
|
2,0 [1,0; 3,5] p1>0,05; p2<0,05 p3>0,05 |
1 [0,5; 1,5] p1>0,05; p2>0,05 |
|
|
Число пересеченных квадратов |
14 [11,0; 22,0] |
10,5 [8,0; 18,5] p1>0,05 |
22 [14,0; 38,0] p1>0,05; p2<0,05 p3>0,05 |
19,5 [16,0; 25,0] p1>0,05; p2<0,05 |
|
|
Груминг (короткий) |
2,5 [0,5; 3,5] |
2,5 [0,5; 4,5] p1>0,05 |
3,5 [2,5; 6,0] p1>0,05; p2,3>0,05 |
3 [2,5; 4,5] p1>0,05; p2>0,05 |
|
|
Время замирания в центре |
1 [0,0; 4,0] |
1 [0,0; 5,0] p1>0,05 |
1,5 [0,0; 5,5] p1>0,05; p2,3>0,05 |
0,5 [0,0; 1,0] p1>0,05; p2>0,05 |
|
|
Уринации |
1 [0,0; 1,0] |
1 [0,0; 1,0] p1>0,05 |
1 [1,0; 1,5] p1>0,05; p2,3>0,05 |
0,5 [0,0; 1,0] p1>0,05; p2>0,05 |
|
|
Число болюсов |
4 [2,0; 6,0] |
3,5 [2,0; 5,0] p1>0,05 |
5 [3,5; 5,5] p1>0,05; p2,3>0,05 |
3,0 [2,0; 6,0] p1>0,05; p2>0,05 |
Источник: составлено авторами.
Данные на конец 3-й недели эксперимента свидетельствовали о статистически значимом снижении числа стоек на 80% и числа норок у животных с гипотиреозом относительно интактных крыс, что указывает на уменьшение двигательной и исследовательской активности животных при нарастающем снижении функции щитовидной железы. В опытной группе на фоне антиоксидантной терапии феруловой кислотой зафиксировано статистически значимое увеличение числа стоек на 600% и числа пересеченных квадратов на 109% в сравнении с контролем. В группе препарата сравнения (этилметилгидроксипиридина сукцината) зафиксировано статистически значимое увеличение числа стоек на 700% и числа пересеченных квадратов на 86% в сравнении с контролем. Кроме того, введение феруловой кислоты при гипотиреозе статистически значимо повышало количество норок на 2 единицы выше относительно контрольной группы животных. Полученные данные свидетельствовали о том, что применение исследуемых антиоксидантов при гипотиреозе способствовало сохранению двигательной и исследовательской активности крыс. Статистически значимых отличий в опытной группе и в группе препарата сравнения по исследуемым показателям на 21-й день моделирования гипотиреоза не зафиксировано (табл.4).
Выводы
1. Введение тиамазола в дозе 5 мг/100 г в течение 21 суток приводит к нарушениям поведенческой активности экспериментальных животных, что связано с дефицитом тиреоидных гормонов. Эти изменения затрагивают двигательную активность и когнитивные функции.
2. В конце первой недели эксперимента использование как феруловой кислоты, так и этилметилгидроксипиридина сукцината статистически значимо уменьшило двигательную и эмоциональную активность крыс, в сравнении с контрольной группой, и не имело статистически значимых отличий от показателей интактной группы крыс.
3. В конце второй недели эксперимента статистически значимых изменений исследуемых показателей в опытной группе и группе препарата сравнения по отношению к контрольной группе не установлено.
4. В конце третьей недели эксперимента применение исследуемых антиоксидантов статистически значимо способствовало сохранению двигательной и исследовательской активности экспериментальных животных.
Заключение
Полученные результаты дают основания для дальнейшего изучения феруловой кислоты в качестве потенциального нейропротекторного средства при гипотиреоидных состояниях. Наиболее выраженное влияние отмечалось на первой и третьей неделях исследования, что подчеркивает важность временного фактора при назначении антиоксидантной терапии.