Введение
За последние три десятилетия сообщается о росте распространенности аллергических заболеваний, которая значительно варьируется в зависимости от региона. Региональные различия могут быть вызваны разными факторами, такими как генетика, загрязнение воздуха, диета, образ жизни и многое другое. Ряд исследований подтверждает генетическую детерминированность восприимчивости к аллергическим заболеваниям. Последние имеют мультифакторный генез, для их инициации и реализации значимы генетические предикторы [1–3].
В последние десятилетия описаны новые эндотипы, определяемые по различным патофизиологическим механизмам аллергических заболеваний, среди которых бронхиальная астма и аллергический ринит. Идентифицирование новых эндотипов различных аллергических заболеваний определило постепенный переход от описания заболевания, ориентированного на симптомы, к поиску информативных биомаркеров иммунопатогенеза и метаболических нарушений [2, 4]. Изучение генетических биомаркеров предикторов дисфункции иммунной системы при аллергической бронхиальной астме (АБА) с аллергическим ринитом (АР) остается актуальной медико-социальной задачей в педиатрии [1, 5]. Аллергические заболевания развиваются под влиянием комплексного взаимодействия наследственных и внешне-средовых факторов. Аномальная регуляция цитокинового ответа, вызванная полиморфизмами генов цитокинов, является ключевым фактором в развитии аллергического воспаления дыхательных путей. Эти генетические вариации могут служить индикаторами иммунопатологических процессов, лежащих в основе аллергических заболеваний [3, 6, 7].
В изучении мультифакторных заболеваний, на развитие которых влияет множество факторов, ключевую роль играет поиск предикторных генов, предрасполагающих к этим болезням. Среди генетических факторов, связанных с аллергией, особое внимание ученые уделяют изучению полиморфных вариантов генов, отвечающих за выработку цитокинов – сигнальных молекул, играющих важную роль в иммунном ответе [8–10]. На сегодняшний день сохраняют актуальность и наиболее интересными являются исследования новых генетических биомаркеров для идентификации подгрупп пациентов с различными иммунно-генетическими профилями, это открывает возможности для создания более эффективных и персонализированных методов лечения, способных повлиять на прогрессирование заболевания и обеспечить целенаправленную профилактику [11]. Данный аспект обусловлен определяющим значением цитокиновой регуляции иммунного ответа, профиля Тh2 лимфоцитов, метаболизма медиаторов аллергического воспаления [12, 13].
Опубликованные в литературных источниках результаты исследований о значимости полиморфизма генов в ассоциации с нарушениями синтеза цитокинов и риском аллергического поражения органов дыхания у детей нередко разнонаправленные, неоднозначные и дискуссионные. Наблюдаемые различия могут быть обусловлены генетической неоднородностью исследуемых популяций, вариативностью критериев оценки изучаемого признака, клиническим полиморфизмом заболеваний, этноспецифическими особенностями и эволюционно детерминированными характеристиками популяционной группы. Исследование полиморфизма генов цитокинов представляет собой актуальную задачу в контексте поиска генетических биомаркеров аллергических заболеваний у детей, поскольку позволяет уточнить генетическую предрасположенность к развитию патологии и оптимизировать стратегии превентивной диагностики [14, 15].
Цель исследования – характеристика полиморфизмов генов цитокинов для идентификации генетических детерминант повышенного риска аллергического заболевания органов дыхания у детей.
Материалы и методы исследования
Проведенное исследование является самостоятельным фрагментом научно-исследовательской работы и выполнено в лаборатории кафедры клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России.
В проспективном исследовании приняли участие 175 детей в возрасте 3–11 лет. Диагнозы аллергической бронхиальной астмы с аллергическим ринитом верифицированы у 75 детей, в группу контроля вошли 100 относительно здоровых детей первой группы здоровья. Состав сравниваемых групп по полу и возрасту был аналогичным. Верификация диагноза и клиническое сопровождение детей осуществлялись в городском аллерго-респираторном центре и центре здоровья, которые являются подразделениями КГБУЗ «Владивостокская поликлиника № 3» г. Владивостока. Верификация заболевания проводилась в соответствии с национальной программой «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика» и международными согласительными документами «The European Pediatric Asthma Group Diagnosis and treatment of asthma in childhood: a PRACTALL consensus report. European Academy of Allergy and Clinical Immunology and the American Academy of Allergy» (PRACTALL), «Global strategy for asthma management and prevention» (GINA) и «Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma» (ARIA) и клиническими рекомендациями. В рамках обследования всем пациентам детского возраста был проведен комплекс диагностических мероприятий, включающий общеклиническое обследование, кожное аллергологическое тестирование и определение концентрации специфических IgE антител к неинфекционным аллергенам и общего IgE в сыворотке крови, а также цитологическое исследование мокроты и назального секрета. Результаты обследования позволили диагностировать у детей исследуемой группы аллерген-индуцированный эозинофильный фенотип с доминированием Т-2 воспаления и аллергическую форму заболевания, обусловленную сенсибилизацией к бытовым аллергенам.
Обоснованием включения ребенка в исследование являлись наличие диагностированной АБА с АР и письменного согласия родителей. В исследование не включались лица, имеющие в истории болезни серьезные соматические патологии, аллергические дерматозы, атопический дерматит, аутоиммунные или другие хронические воспалительные заболевания.
Направлением исследования являлось определение влияния полиморфных генов цитокинов Th1, Th2 профилей на степень риска развития болезни. В группах наблюдения изучали встречаемость полиморфизмов генов цитокинов с точками мутаций IFNγ (T-874A), IL4 (С-589Т), IL6 (C-174G), IL10 (G-1082A), TNFα (G-308A) с последующим типированием ассоциации неблагоприятного аллеля с повышенным риском аллергической бронхиальной астмы с аллергическим ринитом.
Молекулярно-генетический анализ ДНК, выделенной из образцов венозной крови тест-системой Genomic DNA Purification Kit (Roche, Швейцария), проводили с последующим проведением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и аллель-специфичной ПЦР (АС-ПЦР), включая генотипирование с поиском мутаций в генах интерлейкина 4 rs2243250 (С-589Т); интерлейкина 6 rs1800795 (C-174G); интерлейкина 10 rs1800896 (G-1082A); а также фактора некроза опухоли альфа rs1800629 (G-308A). Для определения полиморфного варианта T-874A гена IFNγ использовали метод ПЦР-РВ. Предварительно проводили амплификацию с применением комплектов реагентов «SNP экспресс» ЭФ (НПФ «Литех», Россия). Полученные ПЦР-продукты разделяли методом горизонтального гель-электрофореза в 2 % агарозном геле (НПФ «Литех», Россия) в электрофоретической камере. Визуализацию результатов электрофореза осуществляли с помощью системы VersaDoc MP 4000 Imaging System (Bio-Rad, США) и реактивов производства компании «ГеноТехнология» (Россия).
В исследовании цифровые данные были обработаны с помощью статистического пакета Statistica 13. При анализе применялся широкий спектр статистических методов, включая описательную, параметрическую и непараметрическую статистику, включая корреляционный анализ (Спирмена и многомерный), проверку нормальности распределения (Шапиро – Уилка) и сравнение групп по качественным признакам (Хи-квадрат, χ2) с уровнем значимости 95–99 %. Также оценивалось соответствие распределения генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди – Вайнберга.
Этическая экспертиза дизайна исследования, проведенная Междисциплинарным этическим комитетом ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России, подтвердила его соответствие этическим нормам. В результате была утверждена процедура информирования родителей и получения их добровольного согласия на участие детей в исследовании, гарантирующая защиту прав участников. Исследование проводится в строгом соответствии с этическими стандартами, установленными Правилами клинической практики РФ (приказ Минздрава РФ № 200н от 01.04.2016) и Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации.
Результаты исследования и их обсуждение
Проведенное исследование встречаемости генотипов IFNγ rs2430561 у детей с аллергической бронхиальной астмой и аллергическим ринитом зафиксировало носительство мутантной аллели A rs2430561 в 63,33 % случаев и повышение риска аллергического поражения органов дыхания / заболевания в 2,59 раза (табл. 1).
Таблица 1
Частота встречаемости различных вариантов генов IL4 и IFNγ у детей с АБА и АР в сопоставлении с контрольной группой здоровых детей
|
Полиморф-ный ген цитокина |
Группы, включенные в исследование |
Хи-квадрат |
ОШ (ДИ 95 %) |
Вариант генотипа |
|||
|
Исследуемая группа (дети с АБА и АР, n = 75) |
Группа контроля (дети без патологии, n = 100) |
χ2* = 18,66; при р < 0, 01 |
OR* = 2,59 (1,67–4,00) |
||||
|
IFNγ rs2430561 (T-874A) |
8 |
(10,67 %) |
32 |
(32,00 %) |
Т/Т |
||
|
39 |
(52,00 %) |
56 |
(56,00 %) |
Т/А |
|||
|
28 |
(37,33 %) |
12 |
(12,00 %) |
А/А |
|||
|
Частота аллеля |
55 |
(36,67 %) |
120 |
(60,00 %) |
Т |
||
|
95 |
(63,33 %) |
80 |
(40,00 %) |
А |
|||
|
IL4 rs2243250 |
12 |
(16,00 %) |
75 |
(75,00 %) |
χ2* = 56,97; при р < 0,001 |
OR* = 19,30 (11,23–33,31) |
С/С |
|
40 |
(53,33 %) |
20 |
(20,00 %) |
С/Т |
|||
|
23 |
(30,67 %) |
5 |
(5,00 %) |
Т/Т |
|||
|
Частота аллеля |
64 |
(42,67 %) |
170 |
(85,00 %) |
С |
||
|
86 |
(57,33 %) |
30 |
(15,00 %) |
Т |
|||
Примечание. * – коэффициент отношения шансов (OR) и доверительный интервал (CI 95 %).
Исследование показало, что у детей с аллергической бронхиальной астмой и аллергическим ринитом значительно повышена частота полиморфизма rs2243250 гена IL4, в частности гомозиготного генотипа TT. Носительство данного генотипа ассоциировано с увеличенным риском развития аллергической бронхиальной астмы в сочетании с аллергическим ринитом. В связи с этим определение генотипа IL4 rs2243250 может служить дополнительным генетическим маркером для оценки риска развития аллергических заболеваний дыхательной системы у детей (табл. 1).
Результаты исследования выявили наличие мутантных аллелей TT IL4 rs2243250 и AA IFNγ rs2430561 при АБА с АР, ассоциации генотипа TA IFNγ rs2430561 и СT IL4 rs2243250 и аллелей А и Т с повышенным риском развития АБА. При исследовании генотипов интерферона гамма и IL4 в нескольких литературных источниках отмечена аналогичная связь данных полиморфизмов генов цитокинов с повышенным риском развития аллергического заболевания органов дыхания [5–7].
Оценка прогностического значения генетических полиморфизмов для развития аллергического заболевания у ребенка при встречаемости аллелей полиморфного варианта IL6 rs1800795 при генотипе GG отметила повышение риска АБА в 2,71 раза. В группе детей с АБА в сочетании с распределением генотипов IL6 отличалось между группами детей с АР и здоровых детей. Генотип GG был более распространен у детей с АР. Частота гетерозиготного генотипа GС составила 58,67 % в группе детей с АР, что указывает на его значительную связь с заболеванием (высокий OR).
Таблица 2
Распределение частот генотипов IL6 и TNF-α между исследуемыми группами
|
Полиморф-ный ген цитокина |
Группы, включенные в исследование |
Хи-квадрат |
ОШ (ДИ 95 %) |
Вариант генотипа |
|||
|
Дети с АБА и АР (n = 75) |
Здоровые дети (n = 100) |
χ2* = 20,34; при р<0,001 |
OR* = 2,71 (1,73–4,18) |
||||
|
IL6 rs1800795 |
7 |
(9,33 %) |
33 |
(33,00 %) |
C/C |
||
|
44 |
(58,67 %) |
60 |
(60,00 %) |
C/G |
|||
|
24 |
(32,00 %) |
7 |
(7,00 %) |
G/G |
|||
|
Частота аллеля |
58 |
(38, 67 %) |
126 |
(63,00 %) |
C |
||
|
92 |
(61,34 %) |
74 |
(37,00 %) |
G |
|||
|
TNFα rs1800629 |
15 |
(20,00 %) |
40 |
(40,00 %) |
χ2* = 9,55; при р = 0,05 |
OR* = 1,96 (1,27–3,01) |
G/G |
|
35 |
(46,67 %) |
40 |
(40,00 %) |
G/А |
|||
|
25 |
(33,33 %) |
20 |
(20,00 %) |
А/А |
|||
|
Частота аллеля |
65 |
(43,33 %) |
120 |
(60,00 %) |
G |
||
|
85 |
(56,67 %) |
80 |
(40,00 %) |
А |
|||
Примечание. * – коэффициент отношения шансов (OR) и доверительный интервал (CI 95 %).
Не было выявлено существенной разницы в частоте гетерозиготного генотипа GC IL6 rs1800795 между детьми с аллергическими заболеваниями (58,67 %) и их здоровыми сверстниками (60,00 %).
Найдена связь между полиморфизмом rs1800629 гена TNFα и повышенным риском развития аллергической бронхиальной астмы (АБА) в сочетании с аллергическим ринитом. Дети с АБА и аллергическим ринитом значительно чаще имели генотип АА. Анализ показал, что частота аллеля А была выше у детей с АБА и аллергическим ринитом (56,67 %), а частота аллеля G – ниже (43,33 %) по сравнению со здоровыми детьми, у которых наблюдалась обратная картина (40,00 и 60,00 % соответственно).
Оценка генетических вариантов генов цитокинов показала, что полиморфизм G308A гена TNFα может быть использован для прогнозирования риска развития заболевания. Носительство мутантной аллели А этого полиморфизма увеличивает риск в 1,96 раза. Обнаружена статистически значимая связь между наличием данной аллели и развитием аллергической бронхиальной астмы и аллергического ринита. У детей с этими заболеваниями аллель встречается значительно чаще (56,67 %), чем у здоровых (40,00 %), что позволяет предположить ее роль в прогнозировании риска развития этих аллергических состояний.
Результаты исследования демонстрируют статистически значимую ассоциацию между функционально неблагоприятной аллелью А и повышенной предрасположенностью к заболеванию χ2 = 9,55 при р = 0,05 (OR = 1,96, CI 95 % (1,27–3,01)). В группе детей с АБА и АР гетерозиготный генотип АG фактора некроза опухолей альфа выявлен в 46,67 % случаев, в группе здоровых сверстников 40,00 % (табл. 2).
Анализ встречаемости полиморфизма rs1800896 гена интерлейкина-10 среди детей с АБА и АР отметил преобладание гетерозиготного генотипа GА IL10, а среди здоровых сверстников – гомозиготного генотипа GG (табл. 3). При носительстве гомозиготной аллели А данного полиморфизма в гене интерлейкина-10, достоверно увеличивается риск развития аллергической бронхиальной астмы (при р < 0,001).
Таблица 3
Распределение генотипов IL10 среди детей в каждой из исследуемых групп
|
Полиморф-ный ген цитокина |
Группы, включенные в исследование |
Хи-квадрат |
ОШ (ДИ 95 %) |
Вариант генотипа |
|||
|
Дети с АБА и АР (n = 75) |
Здоровые дети (n = 100) |
χ2* = 32,14; при р < 0,001 |
OR = 3,34 (2,14–5,20)) |
||||
|
IL10 rs1800896 |
15 |
(20,00 %) |
58 |
(58,00 %) |
GG |
||
|
32 |
(42,67 %) |
27 |
(27,00 %) |
GА |
|||
|
28 |
(37,33 %) |
15 |
(15,00 %) |
АА |
|||
|
Частота аллеля |
62 |
(41,33 %) |
143 |
(71,50 %) |
G |
||
|
88 |
(58,67 %) |
57 |
(28,50 %) |
А |
|||
Примечание. * – Критерий χ2 – Хи-квадрат.
Наши результаты согласуются с данными, полученными I.C. Bocsan и соавт. в 2020 г. Их исследование также было посвящено изучению связи между генетическими вариациями в генах цитокинов (IL6, IL10, TNFα) и риском развития аллергической бронхиальной астмы и ринита. Их результаты выявили, что аллель G полиморфизма rs1800795 гена IL6 часто встречается у людей с этими заболеваниями. Кроме того, генотип АА полиморфизма rs1800629 гена TNFα был связан только с бронхиальной астмой.
Заключение
Проведенные исследования с анализом структуры, встречаемости полиморфизмов генов цитокинов, расчетом критерия χ2 и типирования генотипов детей с аллергической бронхиальной астмой и аллергическим ринитом и здоровых сверстников выявили достоверные различия изучаемых характеристик генотипов цитокинов разных профилей. Функционально значимые неблагоприятные полиморфные варианты генов цитокинов IFNγ rs2430561 (T-874A), IL4 rs2243250 (С-589Т), IL6 rs1800795 (C-174G), TNFα rs1800629 (G-308A), IL10 rs1800896 (G-1082A) в генотипе у ребенка можно охарактеризовать как генетические детерминанты повышенного риска аллергической бронхиальной астмы в сочетании с аллергическим ринитом, что позволяет рекомендовать исследование данных аллелей АА IFNγ rs2430561, TT IL4 rs2243250, GG IL6 rs1800795, АА TNFα rs1800629 в качестве дополнительных биомаркеров риска аллергического поражения органов дыхания у детей.