Гормоны щитовидной железы (трийодтиронин (Т3), тетрайодтиронин (Т4)) контролируют обмен веществ, рост и многие функции организма. Их синтез и секреция обусловлены как самой щитовидной железой, так и регулирующим влиянием аденогипофиза и гипоталамуса, составляя гипоталамо-гипофизарно-тиреоидную ось саморегуляции, осуществляемую через Gs-опосредованные рецепторы с повышением экспрессии Са++АТФазы и активацией внутриклеточных сигнальных путей [1, 2, 3]. Гипоталамический тиреотропин-рилизинг-гормон, аденогипофизарный тиреотропин и Т4 работают синхронно для поддержания надлежащего механизма обратной связи и гомеостаза с учетом того, что количество йода, являющегося неотъемлемой их частью, поступает в организм в достаточном объеме, в том числе и в эмбриональном периоде [4, 5]. Снижение или повышение образования тиреоидных гормонов, вызывающих гипо- и гипертиреоз, всегда сопровождаются изменением многих процессов [6, 7], что может способствовать развитию заболеваний различных органов и систем [8, 9].
Так как тиреоидные гормоны влияют на аэробный метаболизм, закономерен интерес к влиянию повышенного их содержания в крови на функции почек – органов, потребляющих значительное количество кислорода. Заболевания почек входят в десятку наиболее часто встречающихся болезней человека с высоким процентом летальности. Кроме того, при неадекватном и несвоевременном лечении почечные болезни из острого периода незаметно приобретают хроническое течение с возникновением осложнений со стороны многих систем организма [10, 11].
Цель исследования: исследовать водовыделительную функцию почек при экспериментальном гипертиреозе на фоне двухмесячной нефропатии.
Материалы и методы исследования. Эксперимент воспроизведен на 50 половозрелых крысах-самцах линии Wistar (204±15г). Исследование было одобрено этическим комитетом академии с проведением его в соответствии со стандартами, установленными Хельсинкской декларацией 1964 года.
Ранее авторы на 34 крысах линии Вистар смоделировали гипертиреоз, и полученные данные, которые были опубликованы [12], нашли отражение и в данной статье (в таблице 2 они представлены в первой и второй строках). И эта группа крыс с гипертиреозом стала контрольной для животных, на которых моделировали гипертиреоз на фоне нефропатии. Гипертиреоз создавался введением той же дозы левотироксина натрия в течение 14 дней, то есть так же, как при создании гипертиреоза на фоне нефропатии.
А животных, на которых ставили опыты, сначала на 6 часов помещали в клетки для сбора самопроизвольно выделяющейся мочи (группа контроля для крыс с нефропатией). В моче спектрофотометрически (спектрофотометр Apel, PD 303, Япония) биотестами определяли содержание креатинина (ЭКОСервис) и белка (Ольвекс). После сбора мочи 10 крысам внутрибрюшинно вводили анестетик общего действия телазол (Zoetis, США) в дозе 0,1мл/100г, и инвазивным способом оценивали объемную скорость почечного кровотока ультразвуковым флуометром (Transonic НТ 313, США). Затем отбирали кровь пункцией сердца и изымали почки, которые разделяли на три слоя. После тщательного их растирания в кварцевом гомогенизаторе с дистиллированной водой в соотношении на 100мг ткани 1мл воды спектрофотометрически определяли содержание мочевины («Агат-Мед», Россия) [13], а натрия и воды – после предварительного взвешивания образцов на электронных весах (GR-120, A&D Co., Япония) и помещения на трое суток в вентилируемый суховоздушный термостат (ТС-1/80 СПУ, Россия) при температуре 50–60оС. Затем образцы повторно взвешивали и по разнице веса рассчитывали процент содержания воды. Пробы растирали в порошок и заливали 0,75н раствором HNO3 из расчета на 100мг ткани 10мл, оставляли на сутки, после чего методом пламенной фотометрии (ПФА-378, Россия) определяли содержание натрия. Эти вещества создают в интерстиции почек осмотическое давление, от которого зависит процесс обратного всасывания воды из канальцев. В плазме крови определяли уровень креатинина и общего белка, а содержание свободных три- и тетрайодтиронина устанавливали с помощью иммуноферментного набора («Вектор-Бест», Россия).
На оставшихся 40 крысах была воспроизведена модель токсического поражения почек трехкратным в течение месяца (в начале и еще два раза через каждые две недели) внутримышечным введением глицерина (0,8 мл/100 г). Так как крысы ведут активный образ жизни и метаболические процессы у них ускорены, то однократное введение им нефротоксиканта не вызывает длительного повреждения почек, поэтому для оценки функции почек при их хроническом поражении необходимо повторное введение нефротоксиканта [14]. Исследования у крыс с нефропатией проводили в конце второго месяца.
В процессе моделирования четыре животных погибли, и оставшихся 36 разделили на группу только с нефропатией (16 крыс) и группу из 20 крыс, которым начали ежедневно в течение 14 дней перорально вводить левотироксин натрия в дозе 5,0мкг/100г («Берлин-Хеми», Германия) для создания модели гипертиреоз на фоне нефропатии [15]. Вся доза левотироксина натрия на 100г массы крыс растворялась с таким расчетом, что была в 0,5 мл воды, которую и вводили через зонд в желудок. Крысам с нефропатией также в течение двух недель перорально вводили аналогичный объем водопроводной воды. После завершения введения левотироксина, который пришелся на конец второго месяца, на следующий день поставили опыт со сбором мочи и определением в ней всех исследуемых показателей. Затем на всех животных, с соблюдением правил проведения экспериментов, в состоянии наркотического сна определяли объемную скорость почечного кровотока, отбирали в шприц кровь из сердца, в плазме которой определяли содержание креатинина, общего белка и тиреоидных гормонов, а в слоях изъятых почек определяли содержание мочевины, натрия и воды.
Для статистической обработки данных применяли программу «GraphPad Prizm 6.03». С учетом того, что у оцениваемых параметров отмечалось нормальное распределение (критерий Шапиро–Уилка), различия между группами оценивали по t-критерию Стьюдента (р<0,05 было принято как статистически значимое отличие).
Результаты исследования и их обсуждение. Введение здоровым крысам левотироксина натрия в течение 14 дней вызвало повышение (р<0,001) в плазме крови содержания свободных три- и тетрайодтиронина, в частности в 2,0 раза Т3 и в 1,9 раза Т4 (табл.1). У крыс с нефропатией в конце второго месяца уровень гормонов щитовидной железы был статистически значимо меньше контроля (табл.1). Двухнедельное введение левотироксина крысам с нефропатией, хотя и повысило содержание этих гормонов, но оно было меньше данных, когда левотироксин вводили здоровым крысам; при этом сохранилась пропорциональность соотношения между гормонами. Уровень трийодтиронина при гипертиреозе на фоне нефропатии по сравнению с данными только при нефропатии повысился в 2,2 раза, а тироксина – в 2,0 раза. Следовательно, у крыс с нефропатией двухнедельное введение левотироксина, так же как и у здоровых животных, вызывает гипертиреоз с повышением содержания в крови свободных Т3 и Т4, однако не столь выраженно.
Таблица 1
Содержание три- и тетрайодтиронина в плазме крови
|
Гормоны |
Стат. показат. |
Контроль (n=10) |
Гипертиреоз (n=34) |
Нефропатия (n=16) |
Гипертиреоз на фоне нефропатии (n=20) |
|
Т3 пмоль/л |
M±m |
3,72±0,35 |
7,58±0,54 |
2,64±0,18 |
5,82±0,35 |
|
р |
|
< 0,001конт. |
< 0,05конт. |
<0,05ГТ // <0,001нефр. |
|
|
Т4 пмоль/л |
M±m |
22,06±1,87 |
41,70±2,92 |
16,28±1,17 |
33,05±1,84 |
|
p |
|
< 0,001конт. |
< 0,05конт. |
<0,05ГТ // <0,001нефр. |
|
|
конт. – достоверность отличий к данным контроля (интактные крысы) ГТ – достоверность отличий к данным гипертиреоза нефр. – достоверность отличий к данным нефропатии |
|||||
Что может быть причиной снижения уровня гормонов в этом случае? Во-первых, гипопротеинемия вследствие повышенной протеинурии, которая является одним из проявлений нефропатии. В результате может происходить потеря белков – транспортеров гормонов щитовидной железы. Поэтому даже при введении левотироксина, способствующего усилению синтеза гормонов, что наблюдалось у здоровых крыс, содержание в крови белков-транспортеров при нефропатии может быть снижено. Во-вторых, большая часть йода, примерно до 90%, выделяется из организма через почки, а при полиурической стадии нефропатии экскреция йода с мочой увеличивается, что будет снижать его количество, необходимое для синтеза гормонов. В данном случае, когда диурез и потеря белков с мочой повышены, то более низкий уровень гормонов в крови может быть связан с усиленной потерей с мочой йода и белков-транспортеров.
Изучение водовыделительной функции почек показало, что диурез только при нефропатии в конце второго месяца статистически значимо (р<0,001) превышал норму – в 1,7 раза, и при гипертиреозе на фоне нефропатии отличие было в 1,8 раза (р<0,001), то есть практически наблюдается одинаковое повышение диуреза (табл.2). Однако основные процессы мочеобразования существенно отличались. Так, при нефропатии скорость клубочковой фильтрации не отличалась от контроля, а увеличение диуреза было ассоциировано со снижением канальцевой реабсорбции воды. При гипертиреозе и нефропатии увеличение диуреза связано с увеличением скорости фильтрации, обратное всасывание воды в канальцах почек не изменилось (табл. 2).
Таблица 2
Диурез и основные процессы мочеобразования
|
Условия экспериментов |
Стат. показат. |
Диурез |
Гломерулярная фильтрация |
Тубулярная реабсорбция |
|
мл/час/100г |
% |
|||
|
Контроль для гипертиреоза |
M±m |
0,19±0,013 |
15,48±1,33 |
98,77±0,21 |
|
Гипертиреоз (контроль для гипертиреоза на фоне нефропатии) n=34 |
M±m |
0,26±0,018 |
21,85±1,63 |
98,73±0,14 |
|
pконт. |
<0,005 |
<0,005 |
>0,1 |
|
|
Интактные крысы (контроль для нефропатии) n=50 |
M±m |
0,17±0,012 |
14,79±1,28 |
98,85±0,19 |
|
Двухмесячная нефропатия (n=16) |
M±m |
0,29±0,016 |
13,18±1,19 |
97,79±0,18 |
|
pконт. |
<0,001 |
>0,1 |
<0,001 |
|
|
Гипертиреоз на фоне двухмесячной нефропатии (n=20) |
M±m |
0,31±0,024 |
21,05±1,62 |
98,52±0,21 |
|
pгт // pнефр. |
>0,1 // >0,1 |
>0,1 // >0,1 |
>0,1 // <0,02 |
|
|
конт. – достоверность отличий к данным контроля (интактные крысы) ГТ – достоверность отличий к данным гипертиреоза нефр. – достоверность отличий к данным нефропатии |
||||
Содержание креатинина в крови у здоровых крыс было 76,79±3,05мкмоль/л, при двухмесячной нефропатии повысилось до 89,45±3,25мкмоль/л с достоверностью отличия (р<0,01). При гипертиреозе уровень креатинина стал незначительно меньше контроля – 72,44±3,58мкмоль/л, а при гипертиреозе на фоне токсического поражения почек уровень этого маркера диагностики состояния почек достиг 86,45±2,92мкмоль/л, что также имело достоверное отличие как от данных контроля (р<0,05), так и от гипертиреоза (р<0,01). Следовательно, содержание креатинина в крови при гипертиреозе, созданном на фоне нефропатии, повышается, но не столь выраженно, как только при нефропатии.
Скорость почечного кровотока у крыс в контроле была 10,11±0,73мл/мин, с гипертиреозом она повысилась на 41,3%(р<0,005). При нефропатии почечный кровоток стал близок к данным контроля – 9,83±0,64мл/мин, в то время как при гипертиреозе на фоне поражения почек повысился на 53,4% (15,08±1,05мл/мин, р<0,005). Следовательно, повышение объемной скорости почечного кровотока способствует ускорению фильтрации жидкости в клубочках и соответственно повышению диуреза при гипертиреозе и его моделировании на фоне нефропатии.
Содержание воды, натрия, мочевины в корковом и мозговом веществах, в почечном сосочке почек крыс контрольной группы и с гипертиреозом статистически значимо не отличались друг от друга (табл.3), что говорит об одинаковом осмотическом давлении. В условиях нефропатии концентрация мочевины и натрия в слоях почек была статистически значимо снижена, в среднем на 18,24%. Одновременно отмечалось и уменьшение содержания воды (табл.3). Такие изменения уровня осмотически активных веществ приводят к снижению давления в интерстиции и, как следствие, тормозят тубулярную реабсорбцию воды, усиливая мочевыделение. При гипертиреозе на фоне нефропатии осмотическое давление, создаваемое мочевиной и натрием, не отличалось от данных, полученных у крыс с гипертиреозом, но было достоверно больше результатов двухмесячной нефропатии (табл.3). Схожая тенденция наблюдалась и по содержанию воды в слоях почек.
Таблица 3
Концентрация мочевины, натрия и содержание воды в слоях ткани почек
Если степень протеинурии у контрольных крыс была 1,12±0,09мг/мл, у крыс с гипертиреозом – 1,75±0,16мг/мл (р<0,01), при нефропатии стала в 3,1 раза больше – 3,49±0,21мг/мл (р<0,001), то при гипертиреозе на фоне поражения почек повысилась еще больше – в 4,2 раза, достигнув величины 5,14±0,29мг/мл. Уровень общего белка в крови у контрольных крыс был 67,25±3,29г/л, при гипертиреозе незначительно снизился, в условиях двухмесячной нефропатии – уже значительнее (57,35±2,17г/л, р<0,05), а при гипертиреозе на фоне нефропатии еще больше – 52,45±1,88г/л, что достоверно отличалось от контроля (р<0,02) и при гипертиреозе (р<0,05), но не от уровня при нефропатии. Таким образом, гипертиреоз вызывает повышение степени протеинурии в 1,5 раза, нефропатия – в 3,1 раза, а гипертиреоз на фоне нефропатии – в 4,2 раза. При этом уменьшение белка в крови отмечается только в двух последних вариантах.
Заключение. При экспериментальном гипертиреозе, моделируемом на фоне нефропатии, выявлено увеличение: концентрации в крови Т3 и Т4, но менее выраженно, чем только при гипертиреозе; спонтанного диуреза вследствие ускорения гломерулярной фильтрации, связанной с увеличением почечного кровотока; концентрации креатинина в сыворотке крови; степени протеинурии. Содержание общего белка в сыворотке крови понижается.