Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщает, что устойчивость к антибиотикам продолжает расти во всем мире, и предупреждает, что приближается период, когда лечение инфекций ими будет неэффективно [1]. Увеличение числа устойчивых бактериальных штаммов вызвало необходимость разработки новых антимикробных агентов, которые можно использовать в лечении заболеваний [2]. Последние годы эпидемии и пандемии показали, что общественное здравоохранение потенциально находится под глобальной угрозой с точки зрения инфекционных заболеваний, и потребность в современных и эффективных противомикробных препаратах для борьбы с возникающими микробными заболеваниями сохраняется. АМП являются потенциальными многофункциональными терапевтическими агентами, которые эффективны в отношении широкого спектра микроорганизмов. Их называют «природными антибиотиками». Некоторые AMП могут вызывать быструю гибель грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов, паразитов, инкапсулированных вирусов или опухолевых клеток в течение нескольких минут. АМП имеют низкий риск развития резистентности и даже могут ингибировать устойчивые к антибиотикам микроорганизмы [3]. Все эти преимущества делают АМП идеальными кандидатами для фармакологических применений.
Цель исследования - изучить классификацию АМП, многогранный механизм действия, возможность использования с антибиотиками с целью предотвращения роста устойчивости у микроорганизмов.
Материалы и методы исследования. Был проведён анализ современной литературы и исследований, существующих по данной теме.
Результаты исследования и их обсуждение. Историческое открытие антимикробных пептидов относится к 1939 году, когда Дюбос выделил антимикробное вещество из штамма почвенной бациллы [4]. Далее было выявлено наличие АМП в структуре прокариот и эукариот. По этим данным, одна только кожа лягушки содержит около 300 различных пептидов. Учёные из Японии смогли изучить антимикробный механизм бомбининов H2 и H4, полученных из кожи лягушки Bombina variegate. Эти вещества продемонстрировали высокую эффективность против возбудителей лейшманиоза. Кроме того, были обнаружены другие антимикробные пептиды: дефензины из лейкоцитов кролика, лактоферрин из коровьего молока и пептиды, полученные из женского репродуктивного тракта. В проводимом исследовании были выделены несколько штаммов бактерий, которые способны продуцировать АМП против Shigella, Salmonella, E. coli и золотистого стафилококка [5].
Группа исследователей представила лактоферрин, модифицированный в N-концевом домене, который проявил высокую активность против микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью [6].
Структурная организация антимикробных пептидов играет ключевую роль в понимании механизмов их воздействия на клетки мишени. Повсеместное значение получила классификация АМП по вторичной структуре. Выделяют следующие виды: α-спиральные, β-пластинчатые, смешанные (α-спиральные/β-пластинчатые) и циклические структуры, а также с отсутствием выраженной вторичной структуры в растворах.
Пептиды α-спирали являются наиболее изученной группой АМП. Например, магайнин из кожи африканской когтистой лягушки X. Laevis; мелиттин, обнаруженный в яде медоносной пчелы Apis mellifera; кателицидин человека, полученный из LL-37. Данные пептиды являются хорошо изученными и представляют собой амфифильную α-спиральную вторичную структуру в мембраномиметической среде. Наличие альфа-спирали играет ключевую роль в механизме взаимодействия с мембраной бактериальной клетки, приводящего к ее гибели. При нарушении структуры альфа-спирали происходит сильное снижение антибактериальной активности. Спирали с противоположным расположением катионных и гидрофобных доменов легче взаимодействуют с мембраной бактерий, тем самым повышая антибактериальную эффективность [7]. Наличие спиральной структуры опосредует гемолитический и токсический эффект на клетки мишени.
В недавних исследованиях Манта [8] представлено значительное снижение гемолитической активности пептидов посредством замены двух необычных аминокислотных остатков, диаминомасляной кислоты и диаминопропионовой кислоты на полярной поверхности амфипатических α-спиральных пептидов, разработанных de novo.
Большая группа пептидов характеризуется β-листовой конформацией, которая состоит по меньшей мере из пары двух β-нитей, связывающихся дисульфидными связями, обеспечивающих стабилизацию и биологические функции пептидов. Присутствие солевых мостиков и циклизация способствуют дополнительной стабилизации вторичной структуры пептидов. β-листовые AMП из-за своей повышенной стабильности не характеризуются конформационными изменениями при взаимодействии с фосфолипидами мембран [9]. Данная группа пептидов проявляет амфипатический характер, присущий β-нитям, которые разделены на полярные и неполярные домены [10]. К β-пластинчатым AMП относятся β-шпилечные пептиды и циклические α-, β- и θ-дефензины. β-шпильки имеют антипараллельные β-слои, стабилизированные дисульфидными мостиками [11]. Протегрины, полученные из лейкоцитов свиней, проявляют антибактериальную активность. Механизм реализации антимикробного эффекта объясняется моделью ступенчатого образования пор, начиная с антипараллельной димеризации в мембранной среде с последующим образованием олигомеров и их сборкой в октамерную структуру пор, которая действует как неконтролируемый канал переноса ионов в биологических мембранах [12].
Дефензины – хорошо описанная и изученная группа АМП с широким спектром действия против бактерий, вирусов, грибков. α-дефензины обнаруживаются в нейтрофилах, а β-дефензины в эпителиальных клетках различных тканей.
Дефензины содержат от 3 до 6 дисульфидных мостиков, а положение внутримолекулярных дисульфидных связей определяет их класс. Связи дисульфидных мостиков в положении Cys1-Cys6, Cys2–Cys4 и Cys3–Cys5 характерны для α-дефензинов, а C1–C5, C2–C4 и C3-C6 для β-дефензинов. θ-дефензины впервые были выделены в лейкоцитах макаки-резуса. Структура θ-дефензинов представлена циклической цистеиновой лестницей с циклическим пептидным остовом, сшитым тремя параллельными дисульфидами. Конформация циклической цистеиновой лестницы обеспечивает антимикробную активность за счёт стабилизации циклического остова [13].
Высокостабильные циклические пептиды характеризуются большой площадью поверхности и ограниченной гибкостью, что обеспечивает наилучшее связывание и селективность [14].
АМП смешанного типа имеют структуру α-спирали / β-листа, обеспечивающую стабилизацию дисульфидных мостиков. CSaβ-содержащие дефензины присутствуют в растениях и насекомых и обладают выраженным антимикробным эффектом [15]. В амфипатической структуре остатки с положительным зарядом находятся в спирали, а β-слой состоит из гидрофобных аминокислотных остатков. АМП имеют неструктурированную форму в водных растворах, но быстро способны изменять конформацию и принимать четко определенную форму.
Амфипатический модельный пептид GL13K находится в неупорядоченном состоянии в воде, проявляет α-спиральную структуру в присутствии цвиттерионных модельных мембран (DOPC) и переходит в преимущественно β-листовую конформацию в анионных мембранах (DOPG) [16].
Понимание вторичной структуры АМП даёт возможность изучить механизм их действия.
Основная мишень АМП – бактериальная мембрана патогена. В современной литературе описано множество моделей их механизма действия, приводящего к осмотическому лизису. Разрушение мембраны возможно с включением сразу нескольких моделей, что было недавно доказано [17].
Модель «бочкообразного стержня» показывает, что пептиды проникают в мембрану и направляют свои гидрофобные участки к липидному ядру бислоя, образуя трансмембранную пору. Экспериментальные доказательства этой модели были получены в результате структурных и биофизических исследований очень гидрофобных последовательностей, некоторые из которых лишены какого-либо заряда [18].
Модель «ковра» предполагает, что АМП накапливаются параллельно поверхности мембраны, образуя «ковер» [19]. Как только достигнута пороговая концентрация пептидов, они оказывают «детергентный» эффект, приводящий к разрыву клеточной мембраны. Обширные экспериментальные доказательства этого механизма были получены для многих катионных амфипатических пептидов, таких как магайнины [20].
Модель «тороидальных пор» подразумевает, что АМП перпендикулярно проникают в мембрану благодаря взаимодействию между липидным бислоем и гидрофильной областью пептидов. При этом мембрана деформируется и, таким образом, образует «тороидальную пору» [21].
«Агрегатная» модель предполагает образование агрегатов пептидов и липидов, что позволяет перемещать АМП через мембраны.
При рассмотрении этих моделей следует иметь в виду, что, с одной стороны, липидные бислои являются мягкими и могут приспосабливать свою форму и толщину к пептидам, вставленным в мембрану. С другой стороны, пептиды покрывают очень динамичное и гибкое конформационное пространство, и при взаимодействии также реагируют с мембраной. Таким образом, в зависимости от состава липидов, концентрации пептидов, соли и буфера может образовываться множество различных супрамолекулярных соединений. Эти соображения были включены в модель SMART, которая учитывает, что пептиды и липиды корректируют свою конформацию и форму при взаимодействии друг с другом, тем самым охватывая полный спектр возможностей взаимодействия между AMП и мембранами [22].
Некоторые пептиды проникают через цитоплазматическую мембрану и нацелены на клеточные процессы, необходимые для выживания патогена, включая ингибирование репликации ДНК, синтез белка, вмешательство в биосинтез нуклеиновых кислот, метаболизм, деление клеток и связывающие липополисахариды (ЛПС) белки [23].
Действительно, было показано, что некоторые катионные АМП образуют комплексы и флоккулируют нуклеиновые кислоты или другие анионные макромолекулы из-за их сродства с отрицательно заряженными фосфодиэфирными связями [24]. Френатин 2.3S интернализуется в бактериальных клетках после дестабилизации их мембран и может связывать нуклеиновые кислоты [25]. Низкие концентрации других пептидов влияют на синтез белка. АМП с триптофаном уничтожают синегнойную палочку за счет подавления экспрессии генов, инициирующих репликацию ДНК [26]. Tur1A связывается с рибосомами и блокирует трансляцию мРНК в белки [27]. Танатин нацелен на бактериальные ЛПС и индуцирует опосредованную ЛПС агрегацию [28]. Тридекаптин блокирует синтез АТФ в бактериях и активен в отношении множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) и устойчивых к колистину энтеробактерий [29]. АМП способны проявлять иммунорегуляторные функции, обеспечивая накопление и активацию иммунных клеток. Дефензины усиливают выработку интерлейкина-1, а кателицидин BF проявляет иммуномодулирующую активность [30].
Антибиотики в сочетании с АМП – перспективная модель лечения, обеспечивающая преодоление антибиотикорезистентности, повышение эффективности, снижение токсических и побочных эффектов, вызванных повышенной дозой препарата. Такое сочетание позволяет увеличить проницаемость мембран бактерий, снизить элиминацию антибиотиков, регулировать внутриклеточный ионный гомеостаз, ингибировать образование биопленки [31]. Сочетание низина с пенициллином, хлорамфениколом, ципрофлоксацином, индолицидином или азитромицином обеспечивает синергический эффект на метициллинрезистентный золотистый стафилококк, предотвращая образование биопленки или ингибируя прикрепление бактерий [32; 33]. Комбинация тетрациклинового антибиотика демеклоциклина гидрохлорида (DMCT) и антимикробного пептида SAAP-148 обладает синергической антибактериальной активностью для борьбы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) штаммов P. aeruginosa PAO1 и P. aeruginosa ATCC27853 [34]. LEAP-2 повышает активность ампициллина против Vibrio parahaemolyticus [35]. Пептид LL-37 человека [36], пептид-P2 из Xenopus laevis [37], HsAFP1, входящий в структуру растительных клеток [38], в комбинации с различными группами антибиотиков показали себя высокоэффективными в борьбе с бактериальными инфекциями. Антипсевдомонадные пептиды, полученные из эскулентина-1a, способны улучшать активность азтреонама в ингибировании роста бактерий и уничтожении клеток pseudomonas [39]. Комбинированное действие АМП обеспечивает лучшую эффективность, однако таких сочетаний немного. К ним относится сочетание PGLa и магаинина 2 - два амфифильных α-спиральных мембранолитических пептида из кожи лягушки, принадлежат к семейству магаининов [40]. Была предложена новая молекулярная модель комплекса PGLa-магаинин 2, в которой каждый мономер PGLa связывается с одной молекулой магаинина 2 на ее С-конце [41]. PGLa быстро внедряются и извлекаются из мембраны, а магаинин 2, наоборот, способен к агрегации на поверхности мембраны, образуя гетеродимеры. PGLa-магаинин 2 позволяет остаткам PGLa и MAG2 хорошо интегрироваться в мембрану [42]. Сочетание магаинина 2 и тахиплесина 1 усиливает распознавание бактериальной мембраны путём образования олигомерных структур перед контактом [43]. В недавнем исследовании группы Бхунии сообщалось, что два AMП, VG16KRKP и KYE28, проявляют синергические антимикробные эффекты против патогенов растений и протеаз за счет формирования необычного пептидного комплекса [44]. Антимикробные эффекты могут быть улучшены при комбинировании с другими соединениями или лекарствами. Наилучшую антибактериальную активность низин проявляет в комбинации с лимонной кислотой против S. aureus и L. Monocytogenes, что связанно с сильным повреждением структуры и высвобождением содержимого клетки [45]. В исследовании Ahn et al. [46] выявлено, что С-концевые 15 аминокислот HBD3-C15 усиливают бактерицидную и антибиопленочную активность дезинфицирующих средств. Комбинированное применение низина А и эпсилон-поли-L-лизина проявляет синергическую активность в отношении грамположительных Bacillus cereus и L. monocytogenes [47].
Антимикробные пептиды имеют хорошие перспективы применения, однако существует ряд проблем при их использовании:
· АМП повреждают клеточную мембрану эукариот и вызывают гемолитические побочные эффекты;
· растущие производственные затраты и технические проблемы ограничивают их производство;
· их стабильность лимитирована определенными значениями рН;
· АМП обладают пониженной активностью в присутствии железа;
· легко гидролизуются протеазами.
В связи с этим идеальный по своим свойствам AMП должен соответствовать следующим характеристикам:
1) высокая антимикробная активность;
2) низкая токсичность для мембран млекопитающих;
3) высокая стабильность к протеазам и окружающей среде;
4) низкая способность к связыванию с сывороткой;
5) простота доступа и низкая стоимость производства.
Рациональный дизайн антибактериальных пептидов должен быть сосредоточен на следующих пяти аспектах: длина цепи, вторичная структура, суммарный заряд, гидрофобность и амфифильность.
Выводы. АМП – это мощная альтернатива антибактериальным лекарственным средствам в борьбе с инфекционными заболеваниями. Разработка синтетических антимикробных пептидов связана с развитием технологий контролируемой полимеризации с возможностью имитировать структуру естественных АМП, что является инновационным подходом в борьбе с растущей распространенностью мультирезистентных инфекций. Антимикробные пептиды имеют различные классификации, но чаще всего подразделяются по вторичной структуре, так как это даёт возможность понимать механизм их действия.