Нерациональное питание, в особенности «Западная диета», – важный фактор риска развития нарушения толерантности к глюкозе и сахарного диабета 2-го типа [1, 2]. Разработка и изучение немедикаментозных методов коррекции метаболических нарушений, ассоциированных с нерациональным питанием, являются актуальной задачей современной медицинской науки.
В отношении транскраниальной электростимуляции (ТЭС-терапии) [3, 4], относящейся к группе методов транскраниальной электротерапии импульсным током (tPCS – transcranial pulsed current stimulation) [5], отечественными учеными накоплен материал по коррекции нарушений углеводного обмена в экспериментах на животных моделях сахарного диабета [6, 7], также существуют клинические исследования, показавшие ее эффективность у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа [8, 9, 10].
В связи с вышесказанным представляет интерес изучение влияния ТЭС-терапии на показатели углеводного обмена на экспериментальной модели, воспроизводящей эффекты «Западной диеты», такой как диета, обогащенная фруктозой и насыщенным жиром животного происхождения (HFFD – high-fat fructose diet) [11, 12, 13].
Цель исследования – изучить влияние ТЭС-терапии на сывороточную концентрацию глюкозы натощак и уровень фруктозамина в динамике на 30-е, 60-е и 90-е сутки нахождения на диете, обогащенной фруктозой и жиром, в эксперименте у крыс.
Материал и методы исследования
Исследование одобрено независимым этическим комитетом при ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России (протокол № 94 от 10.11.2020). Работа выполнена на базе виварного блока учебно-производственного отдела ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России. В исследование включены 180 аутбредных самцов крыс массой 200–250 г. Содержание животных осуществляли в индивидуально вентилируемых пластиковых клетках с древесной стружкой, плотность размещения 350 см2 на одно животное, в условиях 12-часового режима день/ночь, температуре 23oC и влажности 65%, с неограниченным доступом к корму и воде.
Животные распределены на три группы: группа № 1 (контрольная, n=60) – стандартный рацион; группа № 2 (сравнения, n=60) – диета HFFD; группа № 3 (опытная, n=60) – проведение ТЭС-терапии на фоне диеты HFFD. В зависимости от целевой контрольной точки исследования группы делили на три равные подгруппы по 20 крыс в каждой; забор биоматериала и эвтаназию проводили в подгруппе A на 30-е сутки, в подгруппе B – на 60-е сутки и в подгруппе C – на 90-е сутки.
Рандомизацию 180 животных на 3 группы (по 60 крыс в каждой), а затем по каждой группе на 3 подгруппы (по 20 крыс в каждой) проводили до начала исследования с помощью стандартной функции = RAND в Microsoft Excel.
В эксперимент не включали крыс с массой тела, выходящей за границы диапазона 200–250 г, с визуальными признаками заболеваний, травм и анатомических дефектов, а также воспалением в зоне имплантации электродов.
За две недели до начала исследования всем животным проводили вживление подкожных электродов из полированной титановой проволоки толщиной 1,5 мм для электростимуляции (на лоб и затылок), с магнитным контактом для подключения выходов электростимулятора. Данное оперативное вмешательство выполняли под наркозом: телазол 20 мг/кг внутримышечно (Zoetis Inc., Испания) и ксила 5 мг/кг внутримышечно (Interchemie, Нидерланды).
Крыс группы № 1 (контрольной) содержали на стандартном гранулированном корме, общая калорийность 3000 ккал/кг, доля белка 19,5% (ООО «Микс Лайн», Россия). Крыс групп № 2 и № 3 содержали на HFFD диете, включающей стандартный гранулированный корм с добавкой по весу 8% казеина, 15% фруктозы и 17% лярда, общая калорийность 4170 ккал/кг, дополнительно питьевая вода была заменена на 20%-ный раствор фруктозы [13, 14].
ТЭС-терапию проводили только у животных группы № 3, использовали аппарат «ТРАНСАИР-03» (ООО «Центр транскраниальной электростимуляции», Россия). Параметры электростимуляции: импульсный биполярный режим, импульсы длительностью 3,75±0,25 мс, сила тока 0,6 мА, частота тока 70 Гц, продолжительность сеанса 30 мин, частота 1 раз в сутки [15].
Таким образом, в группе № 3 (опытной): подгруппа A – 20 крыс получили 30 сеансов, подгруппа B – 20 крыс получили 60 сеансов и подгруппа C – 20 крыс получили 90 сеансов электростимуляции. В группах № 1 и № 2 животных аналогичным образом подключали к электростимулятору, но на период сеанса ТЭС-терапии прибор был выключен из сети.
По достижении контрольных точек исследования, за 16 часов до эвтаназии, кормление животных прекращалось, при этом доступ к воде оставался свободным. Крыс по описанной выше методике вводили в состояние глубокого наркоза. Выполняли торакотомию и забор крови из правого предсердия одноразовым стерильным шприцем объемом 10 мл, в среднем с одного животного получали 5–6 мл крови. После забора крови выполняли эвтаназию путем смещения шейных позвонков.
Основной исход исследования – сывороточная концентрация глюкозы и фруктозамина при стандартном рационе, диете HFFD, а также диете HFFD на фоне ТЭС-терапии у крыс на 30-е, 60-е и 90-е сутки эксперимента.
Биохимические исследования образцов сыворотки крови выполнены при помощи автоматического биохимического анализатора Random Access А-25 (BioSystems, Испания), строго в соответствии с рекомендуемыми производителем протоколами соответствующих коммерческих диагностических наборов. Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови проводили глюкозоксидазным методом с использованием набора GLUCOSE (11803, BioSystems, Испания). Определение концентрации фруктозамина в сыворотке крови проводили методом, основанным на восстановлении гликированными сывороточными белками соли нитросинего тетразолия, с использованием набора FRUCTOSAMINE (11046, BioSystems, Испания).
Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel 2021 (Microsoft, США), GraphPadPrism 9 (GraphPad Software, США) и Statistica 13.3 (StatSoft, США). Проверка данных на соответствие нормальному закону распределения проводилась с использованием критериев Шапиро–Уилка и Д’Агостино–Пирсона. Описание полученных результатов проводили с использованием среднего арифметического (Mean) и стандартного отклонения (SD), в случае отклонения распределения данных от нормального закона применяли медиану (Ме) и интерквартильный интервал (Q1 – Q3). Различия показателя между исследуемыми группами описывали при помощи процентной разницы, а динамику показателей внутри групп – в виде процентного изменения. Оценку статистической значимости межгрупповых различий при сравнении трех и более групп по исследуемому показателю проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA). Предварительно для оценки равенства дисперсий в исследуемых группах использовали критерий Бартлетта. При F > Fкрит. с p<0,05 отклоняли нулевую гипотезу о равенстве средних. Последующее определение межгрупповых различий при парном сравнении групп проводили с помощью апостериорных (post-hoc) тестов Тьюки и Даннета. При сравнении трех и более независимых групп и отклонения распределения данных от нормального закона применяли критерий Краскела–Уоллиса. Последующее определение межгрупповых различий при парном сравнении групп проводили с помощью апостериорного (post-hoc) теста Данна. В качестве уровня статистической значимости, при котором отвергали нулевую гипотезу, применяли p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе оценки влияния ТЭС-терапии на показатели углеводного обмена у крыс на фоне диеты, обогащенной фруктозой и жиром, проведена как межгрупповая, так и внутригрупповая сравнительная характеристика сывороточной концентрации глюкозы натощак и фруктозамина в группах № 1 (контрольной), № 2 (сравнения) и № 3 (основной) на 30-е, 60-е и 90-е сутки исследования (табл. 1, 2).
При сравнении уровня глюкозы на 30-е сутки от начала исследования между группами № 1 и № 3 статистически значимых различий не выявлено (p>0,05). При этом в группе № 2 показатель был на 38,0% и 23,9% выше (p<0,05), чем в группах № 1 и № 3 соответственно (табл. 1).
Таблица 1
Концентрация глюкозы в сыворотке крови крыс натощак в динамике по контрольным точкам исследования, ммоль / л
|
Подгруппа |
Группа 1 |
Группа 2 |
Группа 3 |
post-hoc тест Тьюки |
|
А 30-е сутки |
5,08±1,87 |
7,46±2,16 |
5,87±1,45 |
p1-2=0,0004 p1-3=0,3682 p2-3=0,0238 |
|
One-way ANOWA F = 8,588, p = 0,0005 |
||||
|
В 60-е сутки |
5,99±2,24 |
9,56±2,97 |
7,42±2,35 |
p1-2=0,0001 p1-3=0,1893 p2-3=0,0261 |
|
One-way ANOWA F = 9,999, p = 0,0002 |
||||
|
С 90-е сутки |
5,79±1,73 |
9,50±2,98 |
7,64±2,24 |
p1-2<0,0001 p1-3=0,0439 p2-3=0,0418 |
|
One-way ANOWA F = 12,22, p < 0,0001 |
||||
|
Анализ внутри групп |
F=1,213, p=0,3049 |
F=3,850, p=0,0270 |
F=4,367, p=0,0172 |
One-way ANOWA |
|
pa-b=0,2447 pa-c=0,4130 |
pa-b=0,0332 pa-c=0,0398 |
pa-b=0,0390 pa-c=0,0167 |
post-hoc тест Даннета |
|
Примечание: При множественном сравнении независимых групп применяли однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOWA); последующие парные межгрупповые сравнения проведены с помощью апостериорных (post-hoc) тестов Тьюки и Даннета; при p<0,05 принималась альтернативная гипотеза о наличии статистически значимых различий; при p>0,05 – нулевая гипотеза об их отсутствии.
Однако при проведении межгрупповых сравнений концентрации фруктозамина на 30-е сутки от начала исследования статистически значимых различий не выявлено (p>0,05) (табл. 2). Тем не менее, медианная концентрация фруктозамина в группе № 2 была на 7,0% и на 4,5% выше (p>0,05), чем в группах № 1 и № 3 соответственно (табл. 2).
Полученные данные свидетельствуют в пользу умеренного нарушения толерантности к глюкозе, развивающейся к 30-м суткам нахождения животных на диете, обогащенной фруктозой и жиром. Отсутствие между группами № 1 и № 3 статистически значимых различий по сывороточной концентрации глюкозы натощак и фруктозамина свидетельствует о защитном влиянии ТЭС-терапии в отношении развития нарушения толерантности к глюкозе на фоне диеты, обогащенной фруктозой и жиром.
На 60-е сутки между группами № 1 и № 3 различий в концентрации глюкозы также не выявлено (p>0,05). В группе № 2 уровень глюкозы был на 45,9% и 25,2% выше (p<0,05), чем в группах № 1 и № 3 соответственно (табл. 1).
На 60-е сутки концентрация фруктозамина в группе № 3 была на 8,2% выше, чем в группе № 1 (p<0,05). При этом в группе № 2 концентрация фруктозамина была на 24,6% и 16,5% выше (p<0,05), чем в группах № 1 и № 3 соответственно (табл. 2).
Таблица 2
Концентрация фруктозамина в сыворотке крови крыс в динамике по контрольным точкам исследования, мкмоль / мл
|
Подгруппа |
Группа 1 |
Группа 2 |
Группа 3 |
post-hoc тест Данна |
|
А 30-е сутки |
597,7 (531,4–635,3) |
641,1 (608,6–684,1) |
613,0 (569,2–652,3) |
p1-2=0,0644 p1-3>0,9999 p2-3=0,5408 |
|
KW=5,336, p=0,0694 |
||||
|
В 60-е сутки |
565,3 (540,5–593,7) |
723,8 (664,5–847,7) |
613,7 (581,7–749,8) |
p1-2<0,0001 p1-3=0,0110 p2-3=0,0725 |
|
KW=26,77, p<0,0001 |
||||
|
С 90-е сутки |
489,8 (443,6–601,6) |
824,1 (723,2–922,9) |
613,4 (568,2–733,8) |
p1-2<0,0001 p1-3=0,0089 p2-3=0,0098 |
|
KW = 34,95, p < 0,0001 |
||||
|
Анализ внутри групп |
KW=10,55 p=0,0051 |
KW=19,62 p<0,0001 |
KW=0,9111 p<0,6341 |
KW-test |
|
pa-b=0,5466 pa-c=0,0028 |
pa-b=0,0140 pa-c<0,0001 |
pa-b=0,7021 pa-c>0,9999 |
post-hoc тест Данна |
|
Примечание: При множественном сравнении независимых групп применяли критерий Краскела–Уоллиса (KW-test); последующие парные межгрупповые сравнения проведены с помощью post-hoc теста Данна; при p<0,05 принималась альтернативная гипотеза о наличии статистически значимых различий; при p>0,05 – нулевая гипотеза об их отсутствии.
Полученные данные свидетельствуют в пользу прогрессирования нарушения толерантности к глюкозе к 60-м суткам нахождения животных на диете, обогащенной фруктозой и жиром, что подчеркивает выраженный рост сывороточной концентрации глюкозы натощак и фруктозамина в группе № 2. Несмотря на умеренный рост концентрации фруктозамина у животных из группы № 3, отсутствие статистически значимых различий между группами № 1 и № 3 по сывороточной концентрации глюкозы натощак свидетельствует о защитном влиянии ТЭС-терапии в отношении развития нарушения толерантности к глюкозе на фоне диеты, обогащенной фруктозой и жиром.
На 90-е сутки исследования концентрация глюкозы в группе № 3 была на 27,6% выше (p<0,05), чем в группе № 1. При этом в группе № 2 концентрация глюкозы оставалась на 48,5% и 21,7% выше (p<0,05), чем в группах № 1 и № 3 соответственно (табл. 1).
Концентрация фруктозамина в группе № 3 на 90-е сутки исследования становилась на 22,4% выше (p<0,05), чем в группе № 1. При этом в группе № 2 концентрация фруктозамина была на 50,9% и 29,3% выше (p<0,05), чем в группах № 1 и № 3 соответственно (табл. 2).
Полученные данные свидетельствуют в пользу развития выраженного нарушения толерантности к глюкозе к 90-м суткам нахождения животных на диете, обогащенной фруктозой и жиром [11], что подчеркивает статистически значимый рост сывороточной концентрации глюкозы натощак и фруктозамина в группах № 2 и № 3. При этом меньшие значения сывороточной концентрации глюкозы натощак и фруктозамина в группе № 3 по сравнению с группой № 2 свидетельствуют о защитном влиянии ТЭС-терапии в отношении развития нарушения толерантности к глюкозе на фоне диеты, обогащенной фруктозой и жиром.
При анализе внутригрупповой динамики сывороточной концентрации глюкозы натощак выявлена статистически значимая (p<0,05) тенденция к ее росту в группе № 2 на 27,3% и в группе № 3 на 30,2%. В группе № 1 статистически значимых изменений показателя не выявлено (p>0,05) (табл. 1; рис. 1).
Рис. 1. Концентрация глюкозы крови натощак в динамике на 30-е (А), 60-е (В) и 90-е (С) сутки исследования у крыс контрольной (№ 1), сравнения (№ 2) и основной (№ 3) групп; знаком * отмечены статистически значимые различия между группами, ббревиатурой ns – их отсутствие
Полученные данные указывают на постепенное прогрессирование нарушения толерантности к глюкозе в группах № 2 и № 3 по мере роста продолжительности нахождения животных на фоне на диете, обогащенной фруктозой и жиром [11, 13].
При анализе внутригрупповой динамики уровня фруктозамина выявлены статистически значимая (p<0,05) тенденция к росту в группе № 2 на 28,5% и умеренное снижение в группе № 1 на 18,1% (p<0,05). В группе № 3 статистически значимых изменений показателя отмечено не было (p>0,05) (табл. 2; рис. 2).
В группе № 3, несмотря на умеренный рост сывороточной концентрации глюкозы натощак, обращает на себя внимание отсутствие статистически значимых изменений в концентрации фруктозамина, что подтверждает наличие умеренного протективного влияния ТЭС-терапии в отношении развития нарушения толерантности к глюкозе на фоне диеты, обогащенной фруктозой и жиром.
Рис. 2. Концентрация фруктозамина в динамике на 30-е (А), 60-е (В) и 90-е (С) сутки исследования у крыс контрольной (№ 1), сравнения (№ 2) и основной (№ 3) групп; знаком * отмечены статистически значимые различия между группами, аббревиатурой ns – их отсутствие
Заключение
Полученные данные подтверждают прогрессирующее развитие нарушения толерантности к глюкозе по мере роста продолжительности нахождения крыс на диете, обогащенной фруктозой и жиром. Применение ТЭС-терапии на фоне диеты, обогащенной фруктозой и жиром, ассоциировано с уменьшением сывороточной концентрации глюкозы натощак и уровня фруктозамина, что свидетельствует в пользу ее терапевтического потенциала в отношении коррекции нарушений углеводного обмена, обусловленных нерациональным питанием с высокой долей в рационе фруктозы и насыщенных жиров животного происхождения.