Клетки воспалительного инфильтрата перитуморозной зоны (ПЗ) злокачественного новообразования все более привлекает внимание исследователей [1, 2, 3]. По современным представлениям воспалительный инфильтрат в прилегающей к опухоли морфологически неизмененной ткани участвует в процессе малигнизации [4], так как опухолевые клетки имеют способность распространяться намного дальше инвазивного края опухоли. В ПЗ малигнизированные клетки способны ремоделировать строму путем взаимодействия с тучными клетками, макрофагами, фибробластами и лимфоцитами. Основной путь активации CD8+ лимфоцитов в ПЗ – это презентация опухолевых антигенов дендритными клетками через связывание Т-клеточного рецептора (TCR) c доменами молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС-II) дендритной клетки с формированием иммунокомпетентных клонов [5]. Так же известен путь активации CD8+ Т-лимфоцитов через CD4+ Т-лимфоциты: именно активированные CD4+ Т-хелперы ПЗ путем секреции эффекторных цитокинов стимулируют миграцию и активность CD8+ Т-лимфоцитов [6]. Также, имеются данные, что CD4+ и CD+ Т-лимфоциты ПЗ могут участвовать в процессе эпителиально-мезенхимального перехода, в процессах инвазии и метастазирования карцином путем активации матриксных металлопротеиназ [7, 8].
Цитотоксические CD8+ T-лимфоциты являются неотъемлемыми участниками перитуморозного воспалительного инфильтрата. В то же время прогностическое значение подсчета CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ карцином не однозначно.
Данилова Н.В. и соавт. (2021) показали, что при раке желудка высокая плотность CD8+ Т- лимфоцитов в ПЗ была ассоциирована с большой глубиной инвазии, более продвинутой стадией заболевания, наличием опухолевых эмболов в сосудах и короткой общей 5-летней выживаемостью [6]. При раке молочной железы по данным Sofopoulos M. и соавт. (2019) пациенты с высоким содержанием перитуморозных CD8+ T-лимфоцитов показывали плохую послеоперационную выживаемость [9].
Однако данные Hu W.H. и соавт. (2015) показали, что при плоскоклеточном раке анального канала имелись сильные положительные корреляции между высоким уровнем перитуморозных CD8+ Т-лимфоцитов, хорошей дифференцировкой опухоли, ранней патологической стадией и лучшим прогнозом [10]. Аналогичные данные получены при раке печени [11]. Не выявлено взаимосвязей содержания перитуморозных CD8+ Т-лимфоцитов с клинико-морфологическими параметрами карцином и прогнозом при раке поджелудочной железы [12].
В научной литературе по данному вопросу имеются отдельные работы, показывающие, что стромальная инфильтрация опухолевых клеток CD8+ Т-лимфоцитами являлась неблагоприятным фактором прогноза при почечно-клеточном раке (ПКР). Так, Nakano O. и соавт. (2001) показали, что большое число стромальных CD8+ Т-лимфоцитов было ассоциировано с более коротким послеоперационным выживанием пациентов. При этом данные авторы заключают, что важен не сам факт увеличения количества CD8+ Т-лимфоцитов, а необходимо учитывать уровень пролиферации иммунных клеток, при неблагоприятном прогнозе индекс пролиферации лимфоцитов был низким [13]. Данные исследований значения CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ ПКР немногочисленны и неоднозначны.
Цель исследования – изучить экспрессию и определить прогностическую значимость плотности распределения CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ при ПКР.
Материалы и методы исследования. Ретроспективно проанализирован операционный материал 74 пациентов после оперативного лечения по поводу ПКР с полным 5-летним наблюдением. Из 74 пациентов 56 к 5-летнему сроку наблюдения были живы, а 18 умерли от рака. Базовые клинико-патологические характеристики пациентов представлены в таблице 1.
Таблица 1
Клинико-патологическая характеристика пациентов
|
Клинико-патологический параметр |
Число пациентов |
% |
|
Пол: мужской женский |
37 37 |
50 50 |
|
Возраст, годы: 30 – 39 40 – 49 50 – 59 60 – 69 70 – 79 |
57,05±1,1; 34-74 3 10 20 36 5 |
4,05 13,5 27 48,65 6,8 |
|
Гистологический вариант опухоли: светлоклеточный папиллярный хромофобный неклассифицируемый |
48 10 9 7 |
64,9 13,5 12,2 9,4 |
|
TNM стадия: І-ΙΙ ІІΙ-ΙV |
52 22 |
70,3 29,7 |
|
Градация по Fuhrman: G І-ΙΙ G ІІΙ-ΙV |
47 27 |
63,5 36,5 |
|
Размер карциномы см: < 7 ≥ 7 |
41 33 |
55,4 44,6 |
|
Локализованные карциномы (N0): Местнораспространенные (N+): |
59 15 |
79,7 20,3 |
Иммуногистохимия и методы подсчета. Резецированные образцы опухолевой ткани фиксировались в нейтральном формалине 24 часа и помещались в парафин для последующего приготовления гистологических препаратов. CD8+ Т-лимфоциты окрашивали иммунногистохимическим методом с использованием системы детекции VENTANA ultraView Universal DAB. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные античеловеческие CD8 (клон SP57, VENTANA, USA; разведение 1:50). Препараты исследовали при помощи микроскопа Leica DM 750 (Германия) и фотографировали цифровой видеокамерой Leica EC3 (Германия) при увеличении х 400. Высчитывали методом случайной выборки среднее количество CD8+ Т-лимфоцитов в 3 полях зрения ПЗ карцином при помощи компьютерной морфометрической программы Image Tool 3.0. За ПЗ принимали ткань, непосредственно прилегающую к новообразованию, и ткань до условно не измененной почки.
Статистический анализ. Все статистические анализы были проведены с помощью программы Statistica 10.0 для Windows. Данные были представлены как среднее ± стандартная ошибка. Для статистических анализов использовали t-тест Стьюдента. Корреляции между числом CD8+ T-лимфоцитов в ПЗ и клинико-патологическими параметрами анализировались с помощью теста Спирмена. Связь переменных с прогнозом оценивали с помощью метода Каплана-Мейера. Значение p < 0,05 считали статистически значимым.
Результаты исследования и обсуждение. При подсчете плотности распределения CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ ПКР (без учета клинико-патологических особенностей) выявлено, что число CD8+ Т-лимфоцитов в 3 полях зрения при увеличении х 400 в среднем составило 74,1±5,6.
При корреляционном анализе с плотностью распределения CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ коррелировали клиническая стадия заболевания, размер карцином, степень анаплазии по Fuhrman, наличие локальных и отдаленных метастазов и общая послеоперационной выживаемость пациентов. Пол, возраст пациентов и гистологический тип опухолей с плотностью распределения CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ взаимосвязаны не были (таблица 2).
Таблица 2
Корреляционные взаимосвязи плотности распределения CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ с клинико-патологическими особенностями карцином
|
Клинико-патологические параметры |
Коэффициент корреляции (r) |
р |
|
Пол больных |
0,21 |
0,08 |
|
Возраст больных |
0,03 |
0,80 |
|
Гистологический вариант карцином |
0,06 |
0,60 |
|
Стадия TNM |
0,54 |
0,0001 |
|
Размер опухоли |
0,54 |
0,0001 |
|
Степень злокачественности по Fuhrman |
0,80 |
0,0001 |
|
Наличие метастазов (N+) |
0,56 |
0,0001 |
|
Общая послеоперационная выживаемость |
0,50 |
0,0001 |
Нами был проведен подсчет плотности распределения CD8+ Т-лимфоцитов в зависимости от клинико-патологических параметров ПКР. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Плотность распределения CD8+ Т-лимфоцитов в перитуморозной в зависимости от клинико-патологических особенностей карцином
|
Клинико-патологический параметр |
Плотность распределения CD8+ Т-лимфоцитов в перитуморозной зоне |
P |
|
Пол: муж. жен. |
90±9,6 56,1±11,2 |
P = 0,001 |
|
Возраст, годы: 30 – 39 (1) 40 – 49 (2) 50 – 59 (3) 60 – 69 (4) 70 – 79 (5) |
8,3±1,2 121,1±24,3 82,8±98 58,1±6,3 75,2±15,4 |
P2-4 = 0,0004
|
|
Гистологический вариант карцином: папиллярный (1) хромофобный (2) светлоклеточный (3) неклассифицируемый (4) |
19,±2,6 59,2±15,7 78,8±6,7 158,2±15,7 |
P1-4 = 0,007 P2-4 = 0,0000001 P3-4 = 0,0000001
|
|
TNM стадия: І-ΙΙ ІІΙ-ΙV |
43,2±4,8 138,5±10,7 |
P = 0,0000001 |
|
Градация злокачественности по Fuhrman: G І-ΙΙ G ІІΙ-ΙV |
24,4±1,7 160,6±9,3 |
P = 0,001 |
|
Размер карциномы, см: < 7 ≥ 7 |
43,6±5,2 111,9±9,5 |
P = 0,0000001 |
|
Локализованные карциномы (N0): Местнораспространенные (N+): |
53,5±4,9 162,2±14,4 |
P = 0,0000001 |
Как видно из представленной таблицы 3 у мужчин среднее число CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ было достоверно выше, чем у женщин. В возрастной группе от 40 до 49 лет отмечали наибольшее содержание CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ, а в группе от 30 до 39 лет наименьшею. При неклассифицируемом раке число СD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ было наиболее высокое, а наиболее низкое было при папиллярной карциноме. У больных с IΙΙ-ΙV клинической стадией заболевания число CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ было увеличено в 3,2 раза по сравнению Ι-ΙΙ стадиями. При степени анаплазии карцином GIIΙ-GΙV содержание CD8+ Т-лимфоцитов возрастало в 6,6 раз по сравнению с GI-GΙΙ степенями (рис. 1). В опухолях с размером ≥ 7,0 см количество CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ увеличивалось в 2,6 раз. У пациентов с локализованными новообразованиями по сравнению местнораспространенными число CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ достоверно возрастало в 3 раза.
Проведение анализа общей 5-летней послеоперационной выживаемости пациентов позволило выявить неблагоприятный прогноз высокой плотности CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ ПКР. Различия между кривыми выживания оказались достоверны (log rang: p = 0,0005) (рис.1).
Рис. 1. Плотность распределения CD8+Т-лимфоцитов в ПЗ в зависимости от степени атипии по Fuhrman: а – при I степени анаплазии отмечается небольшое количество CD8+ Т-лимфоцитов, увеличение х 400; б – значительное количество CD8+ Т-лимфоцитов при IV степени, увеличение х 400. Иммуногистохимическая окраска на CD8
Рис. 2. Кривые выживаемости в зависимости от плотности распределения CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ ПКР
Заключение. В подавляющем большинстве работ, где проводилось изучение лимфоидного инфильтрата опухолей различных локализаций инфильтрация цитотоксическими CD8+ Т-лимфоцитами ассоциировалась с хорошим клиническим результатом. Однако в последние годы появились исследования, данные которых ставят под сомнение концепцию однозначной связи инфильтрации CD8+ Т-лимфоцитами с хорошим клиническим исходом. Так, например, при диффузной крупноклеточной В-лимфоме и лимфоме Ходжкина инфильтрация опухоли этими клетками была взаимосвязана с плохим прогнозом. По словам Giraldo N.A. [14] рак почки и в частности светлоклеточная карцинома, является загадкой в плане изучения микроокружения опухоли, поскольку, по данным литературы, в отличие от большинства злокачественных новообразований, высокая плотность CD8+ Т-лимфоцитов в карциноме коррелирует с плохим клиническим исходом. Так же, в публикации Remark R. и соавторов [15] показано, что инфильтрация CD8+ Т-лимфоцитами метастазов в легкие из светлоклеточного рака почки была взаимосвязана с короткой общей выживаемостью пациентов, в то время как при метастатических поражениях легких из колоректальной карциномы CD8+ Т-лимфоциты являлись фактором хорошего прогноза, что подтверждает актуальность изучения иммунного микроокружения при раке почки.
Рак почки в большинстве случаев представляет собой группу солидных карцином, у которых внутриопухолевый стромальный компонент развит слабо, но у этого заболевания очень хорошо выражена ПЗ, которую обычно называют капсулой. Именно эта зона является той ареной, где происходят важнейшие иммунные события и перестройки. Интересно отметить, что в наших предыдущих работах высокое содержание CD117+ тучных клеток, CD68+ макрофагов и CD97α+ B-лимфоцитов в ПЗ, также, как и число CD8+ Т-лимфоцитов в этой работе достоверно возрастало при продвинутых стадиях заболевания, высокой степени анаплазии, большом размере опухолевого узла, наличии метастазов и при более короткой общей 5-летней послеоперационной выживаемости пациентов. При этом в ПЗ отмечали увеличение ПЗ, активацию ангиогенеза, в эпителии почечных канальцев находили высокую экспрессию Ki-67, AgNORs, p53, bcl-2, нарастали площадь и полиплоидия ядра, что свидетельствует о проявлениях интраэпителиальной ренальной неоплазии. По-видимому, в ПЗ, иммунные клетки воспалительного инфильтрата взаимодействуют друг с другом и оказывают свои иммунные эффекты в едином комплексе. Однако неясно, является ли инфильтрация иммунными клетками ПЗ при ПКР признаком активного иммунного ответа или это их пассивное перераспределение в ответ на выделения цитокинов опухолевыми клетками.
Результаты проведенного исследования совпадают с данными тех авторов, которые указывают на неблагоприятный прогноз течения рака почки при обильной инфильтрации ПЗ CD8+ Т-лимфоцитами. Высокое содержание CD8+ Т-лимфоцитов в ПЗ ПКР имеет прогностическое значение. В свете необходимости поиска новых прогностических критериев ПКР заключаем, что высокий уровень инфильтрации ПЗ CD8+ Т-лимфоцитами может служить фактором прогноза при раке почки.