Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Идиопатический сколиоз является одним из наиболее часто встречающихся заболеваний опорно-двигательного аппарата среди пациентов детского возраста, частота встречаемости составляет 2–3%. Несмотря на то что заболевание до настоящего времени считается идиопатическим, одной из вероятных причин развития данной патологии полагают генетическую природу, что доказывают проводимые сиблинговые и семейные генетические исследования [1]. Генетические мутации являются основной причиной моногенных заболеваний и редких синдромов, в то время как функциональные генетические полиморфизмы часто могут быть связаны с этиопатогенезом многофакторных заболеваний, к каким относят идиопатический сколиоз [2, 3]. Ведущим подходом к идентификации генетических вариантов, связанных с полиморфными заболеваниями, остаются исследования ассоциаций генов-кандидатов и полногеномных ассоциаций «случай – контроль» (так называемые ассоциативные исследования). Трансформирующий фактор роста бета-1 (TGFB1) – полифункциональный цитокин, экспрессия которого связана с физиологическими процессами роста, дифференцировки, регенерации и стрессовой реакцией во многих типах клеток организма [4]. Дикинсон и иные [5] сообщили о высоких уровнях транскриптов и/или белков в соединительных тканях в периоды активного морфогенеза, предполагая, что TGFB1 является важным фактором их роста и дифференцировки. Результаты одного из исследований [6] у пациентов с идиопатическим сколиозом азиатского происхождения показали заметное увеличение уровня экспрессии TGFB1 в апикальных суставных отростках вогнутой стороны деформации позвоночника по сравнению с выпуклой стороной искривления. Этот феномен предполагает участие TGFB1 в качестве этиологического или вторичного фактора в развитии деформации позвоночника. При этом в исследовании экспрессии TGFB1 у 9 пациентов с идиопатическим сколиозом европейского происхождения не было обнаружено различий между выпуклой и вогнутой сторонами деформации позвоночного столба [7]. В другом исследовании ассоциации генов-кандидатов частоты генотипа и аллеля TGFB1 (-509C/T) сравнивали между пациентами с идиопатическим сколиозом и контрольной группой в популяции восточноевропейского происхождения. В общей группе полиморфный аллель Т и гомозиготный генотип ТТ были связаны с большей частотой идиопатического сколиоза и могут рассматриваться как аллель риска и генотип риска соответственно в болгарской популяции (RR >1,5) [8]. Ученые из Китая пришли в своем исследовании к выводу, что в китайской популяции ген TGFB1 может не быть геном предрасположенности к идиопатическому сколиозу, тем не менее он может играть роль в прогрессировании искривления при идиопатическом сколиозе [9]. Рыжков и иные [10] в своем исследовании оценивали предрасположенность к развитию деформации позвоночника идиопатического характера и генетические полиморфизмы C-509T (rs1800469) и Arg25Pro (rs1800471) гена TGFB1 в российской популяции. В исследование были включены 300 пациентов с идиопатическим сколиозом и 300 здоровых подростков того же возраста и пола из Центральной России. Аллель -509T и генотип -509TT гена TGFB1 были достоверно связаны с повышенным риском идиопатического сколиоза как у женщин, так и у мужчин. Регрессионный анализ выявил рецессивную модель генетической ассоциации между полиморфизмом С-509Т гена TGFB1 и идиопатическим сколиозом.

Любое генетическое исследование проверяется минимум на двух популяциях, при этом учитывается количество случаев в каждой выборке пациентов (том числе в контрольной группе). Таким образом, целью данной работы было исследовать ассоциацию полиморфизма гена трансформирующего фактора роста бета-1 (TGFB1) C509T с деформацией позвоночника при идиопатическом сколиозе у детей в российской популяции.

Материалы и методы исследования

В период с 2018 по 2020 гг. нами обследованы 111 детей с прогрессирующим течением идиопатического сколиоза в возрасте от 14 до 18 лет. В контрольную группу вошли 123 подростка 16–18 лет, которые не имели ортопедической патологии, в том числе деформации позвоночника. В обследуемой группе пациентов из 111 детей были 91 девочка и 20 мальчиков, что соответствует статистическому распределению среди подростков с идиопатическим сколиозом. Группа контроля, наоборот, была представлена больше лицами мужского пола: из 123 подростков 48 девочек и 75 мальчиков. Всем детям с идиопатическим сколиозом проведено клиническое и молекулярно-генетическое обследование. В группе контроля детям была взята периферическая кровь на молекулярно-генетический анализ.

В исследуемой группе детям выполняли рентгенографию грудного и поясничного отделов позвоночника в прямой и боковой проекции. Исследуемую группу составили пациенты с идиопатическим сколиозом в основном 4-й степени – 79 детей, и 32 ребенка с 3-й степенью, угол сколиотической деформации по Cobb варьировал от 51 градуса до 138 градусов. Большая часть пациентов имели деформацию грудной локализации (57 детей), у 32 пациентов была выявлена поясничная и грудопоясничная деформация позвоночника, и 22 пациента имели S-образный идиопатический сколиоз.

В качестве биологического материала для генетического исследования полиморфных вариантов гена TGFB1 использовали периферическую кровь. Для выделения ДНК осуществляли забор крови в объеме 3 мл из локтевой вены. После выделения ДНК из периферической крови детей исследуемой и контрольной групп проводили генотипирование образцов ДНК по распространенному полиморфизму гена TGFB1 C509T (rs1800469). Анализ генетических полиморфизмов осуществляли методом ПЦР в режиме реального времени (Real-time ПЦР) на анализаторе CFX96 Touch™ Real-Time PCR DetectionSystem (Bio-Rad, USA) с помощью коммерческих наборов реагентов «SNP-Скрин» (Синтол, Россия) для определения однонуклеотидных полиморфизмов ДНК. Для метода Real-time ПЦР характерны автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Детектировали продукты Real-time ПЦР на двух каналах флуоресценции (Fam и Hex). Интерпретировали результаты по графикам интенсивности сигнала флуоресценции по кинетическим кривым амплификации в автоматическом режиме.

Статистическая обработка данных произведена с помощью онлайн-калькуляторов медицинской статистики (https://medstatistic.ru/calculators,https://wpcalc-com.translate.goog).

Результаты исследования и их обсуждение

Распределение аллелей и генотипов по исследуемому полиморфизму гена TGFB1-509 (C/T) в контрольной группе и группе детей с идиопатическим сколиозом представлено в таблице 1.

Таблица 1

Распределение аллелей и генотипов в контрольной группе и группе детей с идиопатическим сколиозом

TGFB1 C509T	Контроль (n=123)	%	Идиопатический сколиоз (n=111)	%
Аллель C	162	65,8	145	65,3
Аллель T	84	34,2	77	34,7
С/С	52	42,3	44	39,6
C/T	58	47,2	57	51,4
T/T	13	10,5	10	9

Как показано в таблице 1, шанс появления неблагоприятного аллеля как в группе детей с идиопатическим сколиозом, так и в контрольной группе исследования сравнительно одинаков – 34,7% и 34,2% соответственно. При этом патологический генотип Т/Т (монозиготный генотип по двум неблагоприятным аллелям) в группе контроля встречается практически с такой же частотой, как в основной группе: в 10,5% случаев, тогда как у детей с идиопатическим сколиозом – в 9% наблюдений.

Для проверки нормальности распределения генотипов мы использовали тест Харди–Вайнберга отдельно для основной группы и для группы контроля (табл. 2, 3)

Таблица 2

Тест Харди–Вайнберга (HWE) для детей с идиопатическим сколиозом (тест хи-квадрат, df=1)

Примечание. *D – относительное отклонение ожидаемого результата

Таблица 3

Тест Харди–Вайнберга (HWE) для группы контроля(тест хи-квадрат, df =1)

Примечание. *D – относительное отклонение ожидаемого результата

Согласно данным, представленным в таблице 2, ожидаемое значение частот генотипов отличается от действительного, в том числе частота ожидаемого патологического генотипа выше, чем действительного, что отражено в большем отклонении критерия χ2, что говорит о меньшей вероятности появления патологического генотипа в основной группе. В таблице 3 отклонения ожидаемых значений частот генотипов в группе контроля не имеют большого отличия от действительного, значение критерия χ2 имеет небольшое отклонение от 0, следовательно, соответствует равновесию Харди–Вайнберга. При этом в обеих таблицах критерий χ2 ниже критического при заданных степенях свободы (df=1).

Для определения предрасположенности к развитию и прогрессированию деформации позвоночника у детей с идиопатическим сколиозом, согласно современным исследованиям в области генетики, мы использовали показатель отношения шансов (OR – odds ratio). Для полиморфизма гена TGFB1 C509T показатель OR>1 (1,024), что говорит о положительной ассоциации ДНК-маркёра с развитием и прогрессированием деформации при идиопатическом сколиозе.

Таблица 4

Показатель отношения шансов по полиморфизму гена TGFB1 C509T

Для оценки статистически значимой силы связи между фактором риска и развитием патологии, то есть наличием неблагоприятного аллеля Т, развитием и прогрессированием деформации позвоночника при идиопатическом сколиозе, полученные нами данные были обработаны с помощью онлайн-калькуляторов статистики по имеющимся критериям силы связи (табл. 5).

Таблица 5

Критерии оценки силы связи между фактором риска и исходом

* – интерпретация полученных значений статистических критериев согласно рекомендациям Rea&Parker

** – для четырехпольной таблицы, используемой в данном калькуляторе, все три критерия (φ, Крамера, Чупрова) принимают одно и то же значение

Таким образом, в проведенном исследовании на выбранной группе пациентов мы определили достоверно значимую связь полиморфизма гена TGFB1 C509T с развитием и прогрессированием деформации позвоночника у детей с идиопатическим сколиозом. При этом статистическая обработка данных указывает на слабую взаимосвязь между признаками.

Согласно литературным данным, многие ученые причину «неудач» в поиске генов-кандидатов, отвечающих за развитие и прогрессирование деформации позвоночника при идиопатическом сколиозе, видят в фенотипической гетерогенности выборки пациентов. Мы разделили общую группу пациентов с идиопатическим сколиозом на подгруппы согласно варианту сколиотической деформации позвоночника: S-образный сколиоз был выявлен у 14 детей (12,6%), грудной тип искривления – у 61 ребенка (55%), поясничный – у 36 (32,4%) пациентов. В таблице 6 представлено распределение генотипов в подгруппах детей с идиопатическим сколиозом согласно варианту деформации.

Таблица 6

Распределение генотипов и аллелей гена TGFB1 C509T согласно виду сколиоза

Как видно из таблицы 6, патологический генотип ТТ был выявлен в 16% случаев в группе детей с грудным типом идиопатического сколиоза и в 14% случаев – в группе детей с поясничным сколиозом. В группе детей с S-образным искривлением позвоночного столба патологический генотип ТТ не встречался, при этом отмечено, что гетерозиготный генотип СТ, содержащий неблагоприятный аллель Т, встречался в 64% наблюдений.

Для определения предрасположенности к развитию деформации позвоночника того или иного вида мы провели статистическую обработку полученных данных для каждого варианта деформации отдельно по показателю отношения шансов (OR). У пациентов с S-образным сколиозом по полиморфизмугена TGFB1 C509T показатель OR=0,914 (95%CI 0,396–2,107, р<0,05), что говорит об отрицательной связи между неблагоприятным аллелем Т и развитием S-образной деформации позвоночника у детей с идиопатическим сколиозом. Развитие грудного варианта идиопатического сколиоза имело положительную ассоциативную связь с наличием неблагоприятных аллелей Т в гене TGFB1 у пациентов с данным видом деформации, показатель OR=1,495 (95%CI 0,979–2,283, р<0,05). Кроме того, было выявлено, что при поясничном и грудопоясничном варианте идиопатического сколиоза связь между наличием неблагоприятных аллелей Т и развитием деформации была положительна и статистически значима, OR=1,301 (95%CI0,758–2,231, р<0,05).

Заключение

Таким образом, в проведенном нами исследовании было установлено, что связь между развитием деформации позвоночника у пациентов с идиопатическим сколиозом и наличием неблагоприятных полиморфных вариантов гена TGFB1 C509T является статистически слабой. Полученные результаты не противоречат данным других авторов [7, 8], в том числе российских коллег [10]. При этом, опираясь на теорию фенотипической гетерогенности мультифакторных заболеваний [11], каким является идиопатический сколиоз, мы выявили новые данные о выраженности полиморфизмов при различных видах деформации позвоночника. Так, наличие неблагоприятных аллелей по полиморфизму гена TGFB1 у пациентов с S-образным, грудным и поясничным/грудопоясничным идиопатическим сколиозом не всегда имеет связь с фенотипическим проявлением деформации позвоночника, что было доказано при статистической обработке данных в каждой подгруппе пациентов отдельно. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при мультифакторных заболеваниях при разделении исследуемых групп пациентов на подгруппы по различным фенотипическим признакам шанс найти общий фактор риска увеличивается.