Полноценный ангиогенез служит ключевым компонентом развития эндометрия, имплантации и плацентации. Патологическая активация неоангиогенеза может явиться одним из факторов нарушения имплантации при репродуктивных потерях независимо от способов наступления беременности. Известно, что децидуальные клетки регулируют инвазию трофобласта, способствуют дифференцировке иммунных клеток и стимулируют ангиогенез посредством синтеза компонентов внеклеточного матрикса, цитокинов, многочисленных протеаз, метаболитов, ионов, факторов роста, цитокинов, белков матрикса, которые могут модулировать процессы ангиогенеза/васкулогенеза как положительно, так и отрицательно [1–4].
Патология эндометрия, а именно хронический эндометрит, приводит к склерозу сосудистого русла и фиброзу стромального компонента эндометрия, активации патологического неоангиогенеза, поскольку наличие воспалительного процесса изменяет экспрессию эндотелиального фактора в фазу пролиферации и секреции, что в совокупности неизбежно приводит к патологии фертильности [5–7].
Нарушение кровообращения в фетоэмбриональном комплексе при наличии исходного хронического эндометрита и патологическом ангиогенезе, вероятнее всего, связано с несоответствием в созревании и дифференцировке сосудов, а также с повышенным окислительным стрессом. Окислительный стресс возникает при дисбалансе между оксидативными факторами и антиоксидантной системой, которая истощается из-за избытка активных форм кислорода (АФК), обладающих циотоксичностью [8–10].
В компактном слое гравидарного эндометрия сосудистый компонент представлен концевыми отделами артериол и большей частью капиллярным руслом, роль которого в развитии беременности недостаточно изучена. Одним из перспективных маркеров верификации патологического неоангиогенеза может явиться эндотелиальный фактор CD34+ – белок семейства сиаломуцина, который экспрессируются на ранних гемопоэтических и сосудистых клетках-предшественниках в кровеносных сосудах.
Изучение эндотелиального фактора CD34+ в гравидарном эндометрии позволит расширить представления о влиянии патологического неоангиогенеза на развитие беременности у пациенток с исходным хроническим эндометритом, невынашиванием беременности и повторными потерями беременности ранних сроков после ЭКО.
Цель исследования – оценить экспрессию CD34+ в гравидарном эндометрии при неразвивающейся беременности после ЭКО и привычном невынашивании беременности.
Материал и методы исследования. В исследование включены 40 образцов абортивного материала от пациенток с хроническим эндометритом в анамнезе, верифицированным гистологическим и иммуногистохимическим методами: 20 образцов гравидарного эндометрия от пациенток при неразвивающейся беременности после ЭКО (I группа) и 20 образцов гравидарного эндометрия от пациенток при привычном невынашивании беременности (II группа) на сроках от 5 до 8 недель гестации, поступивших в отдел патоморфологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта». Контрольную группу составили 15 образцов абортивного материала, полученного после прерывания беременности по желанию женщины на аналогичном сроке беременности. Критериями включения в исследование для всех групп явились: получение материала хирургическим путем, полноценная гравидарная трансформация эндометрия, отсутствие хромосомной патологии трофобласта, подтвержденное цитогенетическим методом исследования отсутствие признаков инфекционного процесса, иммунологических нарушений, обратного развития гравидарного эндометрия.
Гистологическое исследование
Операционный материал фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине (рН 7,2), после стандартной гистологической проводки в гистопроцессоре Histo-Tek VP1 (Sakura, Япония) заливали в парафин на приборе модульной системы заливки TES 99 (Medite, Германия). Из полученных блоков изготавливали срезы толщиной 3–4 мкм на микротоме Rotary 3002 (PFM, Германия) и окрашивали их гематоксилином и эозином («БиоВитрум», Россия). Исследование проводили на микроскопе Olympus CX31 (Япония) при увеличении ×100, ×200, ×400. Оценивали: наличие маточной беременности (инвазию трофобласта в зоне плацентарного ложа), полноценность гравидарной трансформации компактного и спонгиозного слоев эндометрия (стромы и желез), состояние спиральных артерий, наличие инфильтрации (экссудативной/продуктивной) и других изменений.
Иммуногистохимическое исследование
Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах с использованием одноэтапного протокола с демаскировкой антигена. Верификацию эндотелиального фактора СD34+ [клон QBEnd-10] проводили с использованием первичных антител в стандартном разведении согласно протоколу производителя (Dako) Cytomation. Оценку экспрессии маркера проводили на микроскопе Olympus BX46 и посредством программного обеспечения «CellSens 47 Entry» с последующей морфометрий и применением программы ВидеоТест-Морфология 5.2 (Россия). В каждом срезе оценивали относительную площадь экспрессии (%) – вычисляли как отношение площади иммунопозитивных клеток к общей площади препарата и оптическую плотность экспрессии (усл. ед) – величина вычислялась автоматически. После этого вычислялись средние величины исследуемых показателей.
Статистическое исследование
Статистический анализ проводился в программе SPSSV.23.0. Параметры распределения в выборках оценивали с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Данные представлены в виде среднего (95%-ный доверительный интервал) – М (95% ДИ). Для определения статистически значимых различий между количественными параметрами нормально распределенных данных исследуемых групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с расчетом 95%-ного доверительного интервала. Различия считали значимыми при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Во всех исследованных образцах компактный слой гравидарного эндометрия характеризовался полноценной трансформацией с формированием единого пласта зрелых децидуальных клеток. Отмечался неравномерно выраженный отек компактного слоя от слабо до умеренно выраженного. Железы компактного слоя гравидарного эндометрия имели щелевидный или слабо овоидный просвет и были выстланы уплощенным кубическим эпителием. Капиллярное сосудистое русло в абортивном материале контрольной группы большей частью представлено капиллярами с округло-овальным просветом, умеренным неравномерным кровенаполнением или относительным малокровием (рис. 1А, 1В).
|
|
Рис. 1. Капиллярное русло компактного слоя эндометрия в абортивном материале после прерывания по желанию женщины. Гематоксилин и эозин ув. ×200 (А). ИГХ ув. ×200 (В)
Капиллярное русло в абортивном материале при невынашивании беременности характеризовалось овоидным или щелевидным просветом с умеренной степенью кровенаполнения или относительным малокровием (рис. 2А, 2В).
|
|
Рис. 2. Капиллярное русло компактного слоя эндометрия в абортивном материале при привычном невынашивании беременности.
Гематоксилин и эозин ув. ×200 (А). ИГХ ув. ×200 (В)
Капиллярное русло в компактном слое гравидарного эндометрия при полноценной перестройке в образцах абортивного материала после ЭКО распределено неравномерно, представлено спавшимися сосудами и сосудами с сохраненным просветом. Во всех исследованных образцах отмечалось неравномерное кровенаполнение капиллярного сосудистого русла от относительного малокровия до умеренного кровенаполнения с множественными мелкоочаговыми кровоизлияниями в части образцов (рис. 3А, 3В).
|
|
Рис. 3. Капиллярное русло компактного слоя эндометрия при полноценной гравидарной трансформации в абортивном материале после ЭКО.
Гематоксилин и эозин ув. ×200 (А). ИГХ ув. ×200 (В)
Результаты морфометрического исследования показали, что экспрессия CD34+ в гравидарном эндометрии контрольной группы от пациенток, пожелавших прервать беременность, была статистически значимо ниже по сравнению с основными группами (p=0,0001, p=0,018). Данные представлены в таблице 1.
Таблица 1
Площадь экспрессии эндотелиального маркера CD34+ в гравидарном эндометрии
M (95% ДИ)
|
Группы |
Среднее значение
|
95%-ный доверительный интервал для среднего значения |
F-statistic |
p -value |
|
|
Нижняя граница |
Верхняя граница |
||||
|
Контрольная группа (n=15) |
2,73 |
2,44 |
3,03 |
14,18 |
pk-1 = 0,000 pk-2=0,018 p1-2 =0,015
|
|
I группа (n=20) |
4,25 |
3,75 |
4,75 |
||
|
II группа (n=20) |
3,51 |
3,23 |
3,79 |
||
При сравнении внутри основных групп верифицировано статистически значимое повышение экспрессии эндотелиального маркера CD34+ в I группе при неразвивающейся беременности после ЭКО по сравнению со II группой – абортивном материале от пациенток с привычным невынашиванием беременности (p=0,015).
При оценке оптической плотности экспрессии в контрольной группе выявлено статистически значимое повышение экспрессии данного маркера по сравнению с основными группами. При сравнении внутри основных групп отмечалась тенденция к повышению экспрессии в гравидарном эндометрии у пациенток с неразвивающейся беременностью после ЭКО по сравнению с гравидарным эндометрием от пациенток с привычным невынашиванием беременности (табл. 2).
Таблица 2
Относительная плотность экспрессии эндотелиального маркера CD34+ в гравидарном эндометрии M (95% ДИ)
|
Группы |
Среднее значение |
95%-ный доверительный интервал для среднего значения |
F-statistic |
p-value |
|
|
Нижняя граница |
Верхняя граница |
||||
|
Контрольная группа (n=15) |
0,17 |
0,16 |
0,18 |
20,41 |
pk-1 = 0,000 pk-2=0,000 p1-2 =0,003
|
|
I группа (n=20) |
0,14 |
0,13 |
0,15 |
||
|
II группа (n=20) |
0,12 |
0,11 |
0,13 |
||
В патогенезе влияния хронического эндометрита на морфофункциональные характеристики эндометрия сосудистому руслу отводится особая роль. Формирование патологического неоангиогенеза на фоне воспалительного процесса усугубляет структурно-функциональные характеристики эндометрия, что, безусловно, негативно влияет на его репродуктивный потенциал [11].
На ранних стадиях развития беременности физиологическая гипоксия необходима для адекватной пролиферации и дифференцировки трофобласта. К концу 1-го триместра кровообращение между плацентой и плодом полностью сформировано, и дальнейшее быстрое повышение уровня кислорода важно для стимулирования дифференцировки трофобласта и процессов инвазии во 2-м триместре [12].
Гиперваскуляризация, вероятно, изменяет показатели физиологической гипоксии сначала в секреторном эндометрии, а затем и гравидарном эндометрии при наступлении беременности в сторону гипероксии и избытка активных форм кислорода с формированием окислительного стресса, что может служить самостоятельным фактором прекращения развития беременности в эмбриональные сроки до 8 недель гестации. Полученные нами данные о повышении площади экспрессии маркера CD34+ в гравидарном эндометрии пациенток с разными видами нарушения репродуктивной функции подтверждают эту гипотезу.
Известно, что при хроническом эндометрите нарушается микроциркуляция с последующей ишемией, гипоксией и повреждением клеточных мембран ткани с развитием фиброза и нарушением рецепторного, иммунного и ангиогеного профиля эндометрия, которые детерминируют нарушения имплантации и плацентации. Статистически значимое повышение экспрессии эндотелиального фактора в гравидарном эндометрии при неразвивающейся беременности после ЭКО и при привычном невынашивании беременности свидетельствует об активации патологического неоангиогенеза и нарушении кровоснабжения ткани.
Выводы
Верификация экспрессии маркера CD34+ в гравидарном эндометрии может быть использована в клинической практике для оценки сосудистого компонента эндометрия у пациенток с хроническим эндометритом в анамнезе. Своевременная обоснованная патогенетическая терапия хронического эндометрита во избежание формирования вторичного органического повреждения структурных компонентов эндометрия позволит улучшить репродуктивные исходы у пациенток с репродуктивными потерями после ЭКО и привычным невынашиванием беременности.