Аквапорины (AQP) принадлежат к семейству водных каналов и обеспечивают транспорт воды и малых молекул, таких как глицерин, по биологическим каналам во многих эпителиальных и эндотелиальных клетках [1–3]. К настоящему времени у позвоночных было выделено 13 типов AQP [4]. Классические AQP (1, 2, 4 и 5) проницаемы только для воды. Каналы AQP 3, 7, 9 и 10, также называемые акваглицеропоринами, могут транспортировать глицерин [5]. AQP1 расположен вокруг кожных капилляров [6]. AQP3 проявляется в эпидермальных кератиноцитах [7]; роговой слой эпидермиса не содержит кератиноцитов и AQP3-каналов [8]. AQP1, AQP4 и AQP9 наиболее хорошо описаны в головном мозге [9], причем AQP4 является главным водным каналом. Они играют важную роль в водном гомеостазе и передаче нервных сигналов в головном мозге [10, 11], и их экспрессия быстро индуцируется изменением осмолярности [12, 13], а также воздействием механических или химических раздражителей [14–16]. В легочной ткани AQP5 представляет собой основные водные каналы [17, 18]. Хотя экспрессия AQP5, по-видимому, индуцируется гипертоническим воздействием [19] и подавляется при утоплении в пресной воде [20] в легких мышей, его иммуногистохимические паттерны экспрессии остаются неизвестными в человеческих легких [20]. С точки зрения судебно-медицинской значимости, на сегодняшний день наиболее изученными являются AQP1 и AQP3. AQP1 локализуется в фибробластах, капиллярах, клетках Лангерганса и дендритных клетках [21, 22]. AQP3 обнаружен в адипоцитах гиподермы, дермальных фибробластах, эпидермальных кератиноцитах, меланоцитах, а также в дендритных клетках, клетках Лангерганса и капиллярах [21, 23–26]. В частности, AQP3 активно исследовался учеными в области судебной медицины в прошлом, поскольку данный тип AQP играет основную роль в процессе увлажнения кожи, восстановления эпидермального барьера, а также в заживлении ран [26–28]. AQP5, 7, 9 и 10 также обнаружены в коже и выполняют важные функции, но не были систематически исследованы в судебной медицине [29–31].
В этом обзоре мы обсудим иммуногистохимические исследования аквапоринов, их область применения и соответствующее судебно-медицинское значение, а также имеющиеся ограничения.
Материал и методы исследования
Мы проанализировали исследования, опубликованные в период с 2009 г. по 15 сентября 2021 г. в базе данных PubMed, описывающие изучение аквапоринов в контексте судебной медицины. В процессе выполнения работы мы руководствовались методическими рекомендациями PRISMA 2020 г. (Предпочтительные элементы отчетности для систематических обзоров и метаанализа) [32]. Критерием поиска было наличие слов «aquaporins» и «forensic medicine» в названии, аннотации или ключевых словах. Списки литературы включенных статей были проанализированы вручную с целью поиска дополнительной информации. Авторы независимо друг от друга провели оценку приемлемости и извлечение данных. Нами рассматривались только оригинальные исследовательские статьи, описывающие исследования, проведенные на трупах людей, опубликованные на английском или немецком языках. Приемлемость статьи определялась путем отбора заголовков и аннотаций.
Результаты исследования и их обсуждение
Первоначальный поиск выявил 49 исследований, 23 исследования были отобраны для дальнейшего изучения. После рассмотрения аннотаций 5 исследований были исключены, поскольку 5 описывали экспериментальные исследования на животных моделях, а 1 не представляло достаточных данных для дальнейшего анализа. При ручном поиске в списках литературы не удалось обнаружить статей, соответствующих критериям включения. По результатам поиска в период с 2009 по 2021 гг. было выявлено в общей сложности 18 подходящих исследований. Учитывая изучаемый временной промежуток, в среднем в год публиковалось 1,4 исследования, посвященных изучению AQP в контексте судебной медицины. Большинство исследований было опубликовано в 2014, 2018 и 2021 гг. (n=3 в каждом); более того, почти половина (44%) от общего числа выявленных исследований были опубликованы в период с 2018 по 2021 гг. В большинстве исследований рассматривались повреждения кожи и утопление (n=5 в каждом), после них следовал синдром внезапной детской смерти (СВДС) (n=4). Остальные 4 исследования охватывали различные темы (повреждение легких, черепно-мозговая травма, интоксикация, различие между асфиксией и удушьем от внезапной сердечной смерти). Наиболее частым объектом исследований был AQP4 (n=6), за которым следовали AQP1 (n=5), AQP3 и AQP5 (n=4 каждый). Было также примечательно, что более половины исследований (n=11), посвященных AQP, были опубликованы в «International journal of forensic medicine». 14 из включенных исследований были двухгрупповыми, а 5 – многогрупповыми. Во всех исследованиях было в общей сложности 1,119 исследуемых образца и 1,093 контрольных образца. Различные типы аквапоринов и область их применения представлены в таблице 1.
Таблица 1
Различные типы аквапоринов и область их применения
|
Тип аквапорина |
Потенциальная область применения |
|
1 |
Повреждения легких, повреждения кожи, установление давности и прижизненности повреждений |
|
2 |
Диагностика утопления |
|
3 |
Ожоговые травмы, повреждения кожи, установление давности и прижизненности повреждений |
|
4 |
СВДС, интоксикация, травма, утопление |
|
5 |
Утопление, асфиксия, внезапная сердечная смерть |
|
9 |
СВДС |
Примечание: СВДС – синдром внезапной детской смерти
СВДС
В 4 исследованиях, посвященных СВДС, изучались вариации генов, в основном с помощью генетического анализа. Преимущественно изучался AQP4. Снижение экспрессии AQP4 наблюдалось у младенцев в возрасте >12 недель. Экспрессия AQP4 была ниже у младенцев и детей с генотипом rs2075575 CT/TT, чем у детей с генотипом CC [33]. Не было обнаружено различий в частотах аллелей трех однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) AQP4, которые, как было ранее показано, были связаны с повышенным риском развития СВДС у норвежских младенцев (rs2075575), тяжелого отека мозга (rs9951307), а также с повышенной водопроницаемостью мозга (rs3906956), по сравнению контрольной группой, включающей взрослых [34]. Относительно гена AQP1 была обнаружена статистически значимая взаимосвязь между генотипами rs17159702 CC/CT и СВДС (р=0,02). В гене AQP9 комбинация генотипа TT rs8042354, rs2292711 и rs13329178 чаще встречалась при СВДС, чем в контрольной группе (р=0,03). В группе с СВДС была обнаружена связь между генетическими вариациями в гене AQP1 и курением матери, а также между комбинацией 3×TT в гене AQP9 и обнаружением трупов младенцев в лежачем положении [35]. Для AQP4 в 1 из исследований была обнаружена связь между аллелем T и генотипами CT/TT rs2075575 и СВДС (C против T, p = 0,01; CC против CT/TT, p = 0,03), но не для 3 других ОНП. Для ОНП=rs2075575 связь между соотношением массы мозга и тела, а также генотипом была обнаружена у пациентов с СВДС в возрасте от 0,3 до 12 недель (р=0,014, медианное соотношение CC=10,6, CT/TT=12,1) [36].
Мы пришли к выводу, что специфические вариации в генах AQP1, 4 и 9 наряду с внешними факторами риска и, вероятно, другими генетическими факторами представляют собой генетическую предрасположенность, которая делает младенца подверженным внезапной смерти. Кроме того, генотипы AQP4 CT/TT, по-видимому, связаны с повышенным соотношением массы мозга к массе тела у младенцев [35, 36]. Также на экспрессию AQP4 у младенцев могут влиять как возраст, так и генотип, однако роль AQP4 в патогенезе СВДС еще предстоит выяснить [33]. Еще 1 исследование показало, что вариации в гене AQP4 имеют ограниченное значение в качестве предрасполагающих факторов у детей с СВДС европеоидной расы [34].
Утопление
В 5 исследованиях изучалась экспрессия AQP при утоплении с помощью иммуногистохимии и анализа экспрессии генов. Кроме того, исследования были сосредоточены на различии между утоплением в пресной воде (ПВ) и утоплением в соленой воде (СВ). Внутрилегочная экспрессия гена AQP5 была значительно снижена при утоплении в ПВ по сравнению с таковой при СВ и других случаях, что может быть связано с подавлением экспрессии AQP5 в альвеолярных эпителиальных клетках I типа пресной водой [20]. Другое исследование показало, что статистически значимой разницы в AQP5 легочной ткани между СВ, ПВ и контрольной группой выявлено не было [37]. В почках отсутствовали существенные различия в экспрессии AQP1 и AQP4 между ПВ, СВ и контрольными группами. Иммуногистохимически AQP2 был преимущественно экспрессирован в апикальной плазматической мембране главных клеток собирательного протока во всех образцах почек из ПВ и СВ. Морфометрически наблюдалось значительное увеличение экспрессии AQP2 в апикальной плазматической мембране собирательных протоков в группе СВ по сравнению с ПВ и контрольными группами [38]. В образцах головного мозга среднее значение AQP4-позитивных астроцитов было значительно выше в группе ПВ, чем в СВ и контрольных группах. Вдобавок экспрессия AQP4 была значительно ниже в группе СВ, чем в контрольной группе (р<0,05) [39]. Экспрессия AQP2 (а также аргинин-вазопрессина) была достоверно повышена в почечной ткани в группе СВ (p<0,05) по сравнению с ПВ и контрольной группой [40]. Авторы соответствующих исследований пришли к выводу, что иммуногистохимически обнаруженные AQP2 и AQP4 в почках и головном мозге соответственно могут явиться ценными биомаркерами для дифференциации утопления в ПВ и СВ. 2 исследования экспрессии AQP5 в легочной ткани показали противоречивые результаты.
Повреждения кожи
В 5 исследованиях изучалась, в основном с помощью иммуногистохимии, экспрессия AQP при различных типах повреждений кожи. В центральных частях ожоговых ран, где эпидермис и дерма разрушены, в одном из исследований не было обнаружено AQP3, однако было обнаружено сильное окрашивание AQP3 вдоль края ожоговой раны. Вестерн-блоттинг также показал более сильное окрашивание вдоль ожоговой раны, чем на участке неповрежденной кожи. Количественное определение AQP3 показало его значительно большее количество вдоль ожоговой раны, чем в неповрежденной коже, и отсутствие экспрессии AQP3 в центре ожоговой раны [41]. Изучение экспрессии AQP1 и AQP3 в образцах кожи шеи в случаях ее компрессии не показало различий в экспрессии AQP1 в кожных капиллярах между исследуемой и контрольной группами. Напротив, слабые положительные признаки для AQP3 были обнаружены в неповрежденных образцах кожи, и положительные признаки снова оказались более интенсивными в кератиноцитах в областях компрессии. Морфометрический анализ показал, что доля кератиноцитов, экспрессирующих AQP3, была значительно увеличена в областях компрессии шеи по сравнению с таковой в контрольной группе [42]. Те же авторы изучали экспрессию AQP1 и AQP3 в ранах кожи человека, которые были разделены на разные группы в соответствии с давностью повреждения. В неповрежденных образцах кожи экспрессия AQP1 и AQP3 была снижена в дермальных сосудах и кератиноцитах, и, соответственно, процент AQP1-позитивных сосудов и количество AQP3-позитивных кератиноцитов, по-видимому, повышались с увеличением давности повреждения [43].
Другое исследование объединило генетический анализ и иммуногистохимию для оценки экспрессии AQP1 и AQP3 в коже при судебно-медицинских вскрытиях и ее значения в дифференциальной диагностике предсмертных и посмертных ожогов. Экспрессия гена AQP3 была значительно выше в коже пациентов с предсмертными ожогами, чем в случаях посмертных ожогов, механических ран и в контрольной группе. Напротив, иммуногистохимическая оценка не показала различий в паттернах экспрессии AQP3 между контрольной, предсмертной и посмертной ожоговой кожей. Эта находка была связана с вероятным увеличением экспрессии гена AQP3 в коже для поддержания водного гомеостаза в ответ на обезвоживание, вызванное ожогом [44]. В другом исследовании экспрессия AQP1 и AQP3 была исследована при различных повреждениях кожи, вызванных тупыми и острыми предметами, а также термическим воздействием; механическим повреждением шеи при различных видах асфиксии, огнестрельным оружием и обморожением. Отсутствовала корреляция между экспрессией AQP3 и возрастом, полом, индексом массы тела, продолжительностью агонии и давностью наступления смерти. Не было обнаружено достоверных различий в экспрессии AQP1 между поврежденной и неповрежденной кожей [45].
Подводя итог 5 рассмотренных исследований, можно сказать, что иммуногистохимическое обнаружение AQP3 в коже шеи может предоставлять ценность в качестве маркера для диагностики ее прижизненной компрессии. Кроме того, иммуногистохимическое определение AQP1 и AQP3 в ранах кожи человека, по-видимому, обеспечивает объективную точность при определении давности повреждения, а определение экспрессии гена AQP3, вероятно, полезно для молекулярной судебно-медицинской диагностики прижизненных ожоговых ран.
Другие области применения
В 4 других исследованиях изучались различные аспекты экспрессии AQP. В 1 исследовании сравнивалась внутрилегочная экспрессия AQP1 и AQP5 с помощью количественного определения мРНК в качестве маркеров водного гомеостаза между случаями асфиксии и удушья, внезапной сердечной смерти и острой черепно-мозговой травмы. AQP5 показал сниженную экспрессию при асфиксии по сравнению с экспрессией при удушье, внезапной сердечной смерти и смерти от острой черепно-мозговой травмы, но не AQP1 [46]. Кроме того, молекулярно-патологический анализ посттравматического повреждения альвеол и системных реакций, влияющих на отек легких, включая мРНК AQP1 и APQ5, показал, что экспрессия AQP1 в легочной ткани была значительно выше при постепенном повреждении колющим воздействием, чем в других группах. Что касается экспрессии мРНК AQP5, то различий в экспрессии между всеми группами не было. При иммуногистохимическом исследовании AQP1 он был отчетливо выявлен во всех эндотелиальных клетках сосудов, однако не было выявлено различий в распределении и интенсивности. AQP5 слабо обнаруживался в альвеолярных эпителиальных клетках 1-го типа и единично – в интерстициальных макрофагах [47]. Исследование посмертной мРНК в головном мозге и иммуногистохимической экспрессии, включая AQP4, при судебно-медицинской экспертизе отравления монооксидом углерода, метамфетамином и фенобарбиталом по сравнению с различными случаями травматического повреждения показало более высокую экспрессию AQP4, наиболее выраженную при отравлении метамфетамином. Результаты иммуноокрашивания показали существенные межиндивидуальные различия между группами, без видимых различий в распределении или интенсивности между различными причинами смерти [48]. В другом исследовании изучались экспрессия AQP4 и ее корреляция с гипоксией и нейровоспалением при черепно-мозговой травме человека. AQP4 показал значительное и прогрессирующее увеличение экспрессии между контрольной группой и группами 2 (1-дневная выживаемость) и 3 (3-дневная выживаемость) после острых стадий травматического инсульта. Кроме того, наблюдалось увеличение иммунопозитивности AQP4 в группах 4 (7-дневная выживаемость), 5 (14-дневная выживаемость) и 6 (30-дневная выживаемость), что может указывать на усиление экспрессии AQP4 через 7–30 дней по сравнению с таковой на 1-й день [49].
Таким образом, количественное определение мРНК AQP5 может отличить асфиксию от удушья и внезапной сердечной смерти. Систематический анализ экспрессии генов, в том числе AQP4, с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени может быть полезной процедурой в судебно-медицинских экспертизах отравления метамфетамином, поскольку AQP4 может повышаться в головном мозге во время такого рода интоксикации. Кроме того, AQP4 может быть полезен для оценки времени выживания при черепно-мозговых травмах.
Заключение
За исследуемый 13-летний период было опубликовано относительно мало исследований, в которых рассматривалось судебно-медицинское значение AQP. Основное внимание в этих исследованиях было уделено СВДС, повреждениям кожи и утоплению, в частности различию между утоплением в ПВ и СВ. Исследования СВДС в основном включали анализ генов, в то время как две другие основные темы касались либо иммуногистохимии, либо их комбинации. Специфические вариации генов AQP1, 4 и 9 в сочетании с другими влияющими факторами могут сделать младенцев более восприимчивыми к возникновению СВДС, однако роль AQP, особенно AQP4, остается не уточненной в полной степени. При утоплении накопление AQP2 в почках и APQ4 в головном мозге, по-видимому, может быть использовано для диагностики типа утопления, однако эта методика будет актуальна не для всех регионов Российской Федерации. При повреждениях кожи определение, в частности, AQP3 является возможным дополнительным тестом: например, для определения прижизненности (ожоговых) ран и компрессии кожи, а также для определения давности повреждений. Также AQP5 можно было бы использовать для того, чтобы отличить удушье от внезапной сердечной смерти, а AQP4 можно было бы использовать для временного разграничения пережитых черепно-мозговых травм. Интересные исследовательские подходы можно найти в соответствующих исследованиях, указывающих на то, что изучение AQP потенциально может обеспечить значительную дополнительную ценность для ответов на некоторые вопросы. Комбинация иммуногистохимии и анализа экспрессии генов, по-видимому, полезна в каждом случае для повышения статистической значимости.
Настоящий обзор был ограничен тем фактом, что в него были включены только исследования на людях. Экспериментальные исследования или исследования на животных были намеренно опущены. Акцент был сделан на исследованиях, где возможно немедленное практическое применение и где результаты могут, в лучшем случае, повысить эффективность расследований уголовных дел.
Однако удивительно, что существует лишь несколько последующих исследований и что они часто проводились одной и той же исследовательской группой. Поэтому следует отметить, что частые заявления авторов о необходимости дальнейших исследований для оценки ценности и применимости AQP в контексте судебной медицины в значительной степени остались без внимания научного сообщества.
Тем не менее этот обзор, безусловно, показывает потенциал использования AQP в судебной медицине и свидетельствует, что, несмотря на относительно небольшое количество исследований, которые были проведены на людях на сегодняшний день, существуют очень интересные и потенциально релевантные исследовательские подходы, которые стоит использовать.