Адреналин относится к стресс-реализующим гормонам, его важнейшим эффектом является интенсификация работы органов и систем организма для оптимального ответа на стрессор. Усиление функционирования органов повышает их потребность в кислороде, поэтому задача катехоламинов также заключается в обеспечении этой потребности. Доставка кислорода связана с работой функциональной системы транспорта кислорода. В нее включены сердечно-сосудистая, дыхательная и эритроцитарная системы. В доступных источниках информации имеются сведения о влиянии катехоламинов на каждый компонент данной системы в отдельности. Наше исследование направлено на комплексную оценку кислородтранспортной системы в условиях гиперкатехоламинемии.
Цель работы – провести оценку морфологических и функциональных изменений кислородтранспортной системы в динамике гиперкатехоламинемии у белых крыс.
Материал и методы исследования. Исследование проводилось на 32 белых нелинейных крысах-самцах массой 240–280 г в зимнее время. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Все работы с крысами проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией и приказом Минздрава РФ, были одобрены локальным Этическим комитетом Академии. Гиперкатехоламинемию воспроизводили путем однократного введения адреналина гидрохлорида (эпинефрина – Московский эндокринный завод, Россия) подкожно в дозе 2 мг/кг массы [1]. Далее через 1 час (8 крыс), 24 часа (8 крыс), 72 часа (8 крыс) проводили оценку морфологических и функциональных изменений кислородтранспортной системы. Также было использовано 8 животных для получения контрольных значений. У крыс под золетиловым наркозом проводился забор крови из левого желудочка в пробирку с цитратом натрия для оценки состояния эритроцитарной системы, затем извлекались сердце и легкие для патоморфологического и патогистологического исследования.
Сердце и легкие извлекались целиком для фиксации в 10%-ном нейтральном формалине. Далее фрагменты тканей обезвоживали с помощью 99%-ного изопропилового спирта и заливали парафином. На санном микротоме «Microtom» (Россия) выполняли срезы толщиной 5–6 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. При оценке миокарда обращали внимание на состояние кровообращения, степень альтерации кардиомиоцитов, наличие признаков асептического воспаления. При исследовании легочной ткани оценивали просвет и уровень секреции в бронхах, признаки расстройства кровообращения в легких.
При оценке состояния эритроцитарной системы определяли концентрацию эритроцитов, гемоглобина, поверхностную цитоархитектонику красных клеток крови, агрегационную способность эритроцитов и их деформируемость. Содержание эритроцитов и гемоглобина определяли унифицированными методами. Поверхностную цитоархитектонику оценивали с использованием фазово-контрастного устройства после фиксации эритроцитов 1%-ным раствором глутарового альдегида (Sigma) на среде 199. Подсчитывали относительное количество измененных эритроцитов по классификации Г.И. Козинца (1984). Выделяли дискоциты – эритроциты правильной формы (1-й класс), эритроциты с 1 выростом (2-й класс), «гребнем» (3-й класс), клетки с множественными выростами (4-й класс), в форме тутовой ягоды (5-й класс), стоматоциты (6-й класс), сфероциты (7-й класс), сфероэхиноциты (8-й класс), эритроциты в форме спущенного мяча (9-й класс) и дегенеративно измененные формы (10-й класс). Красные клетки крови 2–5-го класса относили к обратимо измененным, остальные классы – к необратимо измененным. Подсчет осуществлялся в препарате «раздавленная капля» на 200 эритроцитов под увеличением x900. Микрореологический показатель – агрегацию эритроцитов, который характеризует движение крови в микрососудах, – оценивали автоматическим агрегометром эритроцитов МА1 («Myrenne», Германия). При этом агрегационная способность красных клеток крови определялась через 5 и 10 секунд после остановки (М(5) и М(10)) и на низкой скорости сдвига 3 с-1 (М1(5) и М1(10)). Для оценки деформируемости эритроцитов – также важного микрореологического показателя – использовали автоматический прибор ИДА-4 и поликарбонатные трековые мембраны Hemafil («Whatman», Германия) с диаметром пор 3 мкм. Определяли начальную скорость свободного протекания эритроцитарной суспензии под действием силы 60 мм водного столба. По этой методике показателем деформируемости красных клеток крови является индекс ригидности, который рассчитывали по следующей формуле: 
, где tb – время, за которое 250 мкл ресуспендирующего раствора проходит через фильтр; ts – время, за которое проходит 250 мкл суспензии эритроцитов через этот же фильтр; Гт – показатель гематокрита.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью программы STATISTIKA-6,0 (StatSoft, Inc.). Так как полученные результаты не подчинялись нормальному распределению, их сравнение осуществляли с помощью критериев Манна–Уитни и Колмогорова–Смирнова. Достоверными считали отличия при р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. Через 1 час после введения адреналина в сердце патогистологически можно увидеть признаки спазма интрамуральных артерий, в капиллярах – усиленную агрегацию эритроцитов, а также явление краевого стояния лейкоцитов и лейкодиапедез. При этом в зоне межжелудочковой перегородки и в субэндокардиальных отделах отмечаются волнообразная деформация, очаги фрагментации кардиомиоцитов, а при большом увеличении – вакуольная дистрофия сократительных волокон (рис. 1, 2). В легочной ткани – признаки венозной гиперемии, бронхи спазмированы, секреция слизи в них повышена.
Со стороны эритроцитарной системы отмечается повышение кислородной емкости крови: возрастает концентрация эритроцитов на 34% и гемоглобина на 22% (таблица).
Рис. 1. Волнообразная деформация кардиомиоцитов. Ув. х120
Рис. 2. Вакуолизация цитоплазмы кардиомиоцита. Ув. х1200
Одновременно меняется поверхностная цитоархитектоника: статистически значимо снижается процент клеток с множественными выростами – на 60%. При оценке агрегации эритроцитов в этот период эксперимента наблюдается увеличение показателей М(5), М(10), М1(10) на 78%, 105% и 45% соответственно, то есть данный процесс интенсифицируется. Однако деформируемость эритроцитов меняется в положительную сторону – она возрастает, ригидность мембран снижается на 35% (таблица).
Изменения в сердечной мышце в этот период наблюдения можно объяснить чрезмерной интенсификацией силы и частоты сокращений, преимущественно за счет частоты. При этом укорачиваются диастола и время питания сердца, следовательно, возникает некоронарогенная ишемия миокарда. Спазм сосудов может быть связан как с избыточным накоплением свободнорадикальных продуктов, так и с возникновением эндотелиальной дисфункции в условиях избытка катехоламинов [2, 3]. Нарушения в легких могут быть, с одной стороны, результатом острой левожелудочковой сердечной недостаточности, с другой – последствием развития респираторного дистресс-синдрома на фоне эндотоксемии [4]. Повышение агрегации эритроцитов может быть связано с активацией α-адренорецепторов красных клеток крови [5]. При этом меняются эффективный отрицательный заряд их мембран, предотвращающий избыточную агрегацию, а также работа натрий-калиевой АТФ-азы, что дополнительно усиливает межклеточное взаимодействие. Наши результаты совпадают с данными об инкубации эритроцитов с адреналином in vitro. Повышение деформируемости может быть связано с активацией β-адренорецепторов эритроцитарных мембран, которые повышают ее текучесть через стимуляцию аденилатциклазы. Развитие эритроцитоза носит рефлекторный характер и связано с выходом крови из депо, так же как и уменьшение обратимо деформированных эритроцитов. При этом механическое воздействие сердечно-сосудистой системы на них было минимальным.
Изменения эритроцитарной системы крыс при гиперкатехоламинемии (Me (Q1;Q3))
|
Показатели |
Контроль |
1 час |
24 часа |
72 часа |
|
Концентрация эритроцитов, Т/л |
5,45 (5,10; 5,81) |
6,75* (6,46; 7,45) |
5,89# (5,61; 6,35) |
5,58 (5,06; 6,39) |
|
Концентрация гемоглобина, Т/л |
114,0 (104,5; 120,3) |
128,0* (113,5; 149,8) |
115,0# (109,8; 119,0) |
110,0 (106,8; 113,5) |
|
Содержание дискоцитов, % |
76,5 (70,0; 85,5) |
85,0 (78,0; 93,0) |
59,5# (57,8; 80,8) |
46,0* (34,3; 62,8) |
|
Обратимо деформированные эритроциты, % |
19,0 (12,8; 27,3) |
12,0 (6,75; 28,5) |
37,0 (13,8; 39,5) |
49,0* (36,3; 59,0) |
|
Необратимо деформированные эритроцитов, % |
2,50 (1,75; 3,25) |
1,00 (1,00; 2,50) |
2,50 (1,00; 3,75) |
6,50*# (5,50; 7,25)
|
|
М(5), усл. ед. |
1,17 (0,50; 2,20) |
2,33* (1,80; 3,83) |
3,68*# (3,32; 4,56) |
1,97# (0,50; 2,00) |
|
М(10), усл. ед. |
4,25 (0,50; 5,60) |
7,13* (4,53; 11,2) |
12,4*# (6,80; 15,9) |
4,87# (0,50; 6,07) |
|
М1(5), усл. ед. |
3,70 (2,83; 6,23) |
6,83 (6,33; 7,50) |
8,57* (6,76; 9,37) |
5,40# (4,93; 5,87) |
|
М1(10), усл. ед. |
7,94 (5,30; 17,3) |
17,7* (13,9; 18,8) |
21,2* (14,3; 24,7) |
13,3# (12,9; 15,0) |
|
Индекс ригидности, усл. ед. |
68,3 (58,4; 75,2) |
37,3* (31,4; 53,3) |
39,9* (36,4; 58,8) |
47,7 (43,8; 48,0) |
Примечание: * – достоверные отличия от исходных значений, # – достоверные отличия от предыдущего срока наблюдения (р<0,05).
Через 24 часа после введения адреналина выявляются участки фокального некроза кардиомиоцитов с появлением в этой зоне лейкоцитарной инфильтрации. В микрососудах наблюдаются признаки гемостаза и венозной гиперемии. В ткани легких выявлено острое полнокровие на фоне интерстициального отека (рис. 3).
Со стороны эритроцитарной системы также отмечаются существенные изменения. Концентрация эритроцитов и гемоглобина статистически значимо снижается относительно предыдущего срока наблюдения, возвращаясь к значениям контроля. Со стороны поверхностной цитоархитектоники возникают изменения в содержании дискоцитов по сравнению с 1-м часом эксперимента: их процент снижается почти на треть (таблица). Агрегация эритроцитов еще больше усиливается. Относительно контроля показатель М(5) возрастает на 196%, относительно 1-го часа – на 66%, М(10) – на 253% и 73% соответственно, М1(5) статистически значимо повышается только по сравнению с контрольными значениями на 73%, М1(10) также выше контроля на 89%. Деформируемость красных клеток крови сохраняется повышенной относительно контрольных значений (таблица).
Рис. 3. Полнокровие, отек межальвеолярных перегородок. Ув. х480
Рис. 4. Диапедез эритроцитов в просветы альвеол. Ув. х480
Полученные результаты показывают сохранение нарушений кислородтранспортной системы через 24 часа после введения адреналина. Отмечаются патоморфологические изменения как в сердечной ткани, так и в легочной. В литературе описывается обратимость катехоламиновых инфарктов, но в нашем эксперименте изменения миокарда носят хоть и мелкоочаговый, но необратимый характер. Это отрицательным образом сказывается на кровообращении легких, вызывая в них венозный застой. Одновременно возникающая эндотоксемия приводит к усиленному пропотеванию жидкости из сосудов в интерстиций, формируя признаки интерстициального отека легких. Нормализация количественных показателей эритроцитарной системы происходит как в результате возвращения красных клеток крови в депо, так и усиления элиминации поврежденных клеток. Изменение агрегационных свойств эритроцитов можно объяснить сохраняющейся активацией α-адренорецепторов эритроцитов, вероятно, за счет увеличения образования эндогенных катехоламинов. Увеличение деформируемости отражает влияние катехоламинов на β-адренорецепторы. Изменение цитоархитектоники может быть связано с интенсификацией движения крови и более активным повреждением мембран эритроцитов, а также изменением водно-электролитного баланса в условиях действия стресс-реализующих гормонов.
Через 72 часа патогистологическое исследование сердца выявляет сохраняющийся отек стромы. В зонах, где возник фокальный некроз кардиомиоцитов, отмечаются явления плазморексиса и кариолизиса на фоне отчетливых признаков воспалительно-клеточной реакции. В неповрежденных участках желудочков сердца кардиомиоциты сохраняют поперечную исчерченность с местами волнистой деформации. В ткани легких сохраняются признаки венозного застоя, повышенной проницаемости сосудов с пропотеванием жидкой части крови и форменных элементов в просвет альвеол (рис. 4).
Со стороны эритроцитарной системы количественные изменения отсутствуют: содержание красных клеток крови и гемоглобина не меняется. Однако поверхностная цитоархитектоника еще сильнее нарушается: возрастает процент клеток 10-го класса на 222% и соответственно необратимо деформированных эритроцитов в 2 раза по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. По сравнению с контролем снижено число дискоцитов на 37%, увеличено количество обратимо деформированных эритроцитов на 123% и необратимо деформированных на 129% (таблица). Показатели агрегации красных клеток крови снижаются относительно предыдущего срока наблюдения: М(5) на 65%, М(10) на 62%, М1(5) на 31%, М1(10) на 32% и не отличаются от контрольных значений (таблица).
По результатам патогистологического исследования локальные изменения в сердце в этот период наблюдения сохраняются, что, вероятно, сказывается на сократительной функции левого желудочка. В легких на фоне продолжительного венозного застоя возникает асептическое воспаление, нарастает эндотоксемия, которая приводит к пропотеванию жидкости уже в полость альвеол и формированию альвеолярного отека легких. Изменения поверхностной цитоархитектоники можно объяснить активным механическим воздействием на эритроциты в начале эксперимента, нарушения их мембран сохраняются и прогрессируют. Нормализация агрегационной способности эритроцитов в этот период наблюдения связана со снижением активности стресс-реализующих механизмов и, следовательно, активации адренорецепторов эритроцитов. Однако деформируемость их мембран остается выше значений контроля, что может быть отражением цитопротекторного влияния стресс-лимитирующей системы. Также, по данным нашего предыдущего исследования, в этот период повышается концентрация оксида азота в крови, который положительно влияет на микрореологические показатели [1, 6].
Таким образом, гиперкатехоламинемия отрицательно влияет на функционирование всех компонентов кислородтранспортной системы. В 1-й час эксперимента возникают признаки ишемии в сердце, нарушаются вентиляция и кровообращение в легких, возрастает агрегационная способность эритроцитов. Компенсаторные механизмы в этот период – развитие эритроцитоза и деформируемости эритроцитов. Через 24 часа после введения адреналина прогрессируют нарушения в легких и сердце, а также агрегационной способности эритроцитов при сохранении повышенной деформируемости красных клеток крови. Через 72 часа в легких усиливаются нарушения, агрегационная способность эритроцитов возвращается к норме, однако их поверхностная цитоархитектоника существенно нарушается при сохранении повышенной деформируемости.