Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Ведущей причиной смерти у комбустиологических пациентов, наряду с ожоговой септикотоксемией, является ожоговый шок, развивающийся с первых минут после получения термических ожогов [1]. При тяжелом ожоговом шоке достаточно быстро формируется острая систолическая и диастолическая недостаточность миокарда, что приводит к летальному исходу [2; 3].

При изучении механизмов, лежащих в основе развития сократительной недостаточности миокарда левого желудочка при ожоговом шоке, информативным является проведение морфологических исследований на ультраструктурном уровне. Учитывая, что наиболее чувствительными органеллами кардиомиоцитов, реагирующими на малейшие изменения гомеостаза, являются митохондрии [4-6], нам представилось целесообразным проведение стереологического морфометрического исследования ультраструктуры митохондрий, играющих важную роль в энергетическом обеспечении сократительной способности миокарда. При планировании и оформлении дизайна исследования предполагалось изучить в кардиомиоцитах основные подтипы митохондрии с учетом их локализации и функциональной нагрузки: интермиофибриллярные, субсарколеммальные, и перинуклеарные [7; 8].

Цель исследования: выявить особенности ультраструктуры основных подтипов митохондрий кардиомиоцитов при тяжелом ожоговом шоке.

Материал и методы исследования. Исследуемый материал миокарда передней стенки левого желудочка сердца был получен при проведении раннего секционного исследования в случаях летальных наблюдений пациентов, умерших от тяжелого ожогового шока в областном комбустиологическом центре. Забор образцов миокарда осуществляли на аутопсии, проводимой через 2 часа после констатации биологической смерти у погибших (N=5) от тяжелого ожогового шока (3 мужчины и 2 женщины; возрастная категория 32-44 года). Все погибшие имели термические ожоги 2-4 степени, площадью от 50 до 80%, полученные на пожарах, т.е. при действии пламени. Летальный исход всех пациентов был связан с развитием тяжелого ожогового шока при переходе его в рефрактерную стадию в первые двое суток с момента получения ожоговой травмы. В качестве контрольной группы использовали аутопсийный материал, который был забран при проведении ранней аутопсии, через 2 часа после констатации биологической смерти у доставленных машиной скорой помощи скоропостижно умерших мужчин (N=3) от «внезапной сердечной смерти» (возрастная категория 35-45 лет). Все аутопсии проводились в танатологическом отделе ГБУЗ НСО «Новосибирское областное клиническое бюро судебно-медицинской экспертизы», куда были доставлены тела умерших. Забор материала осуществлялся на основании Приказа Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 12 мая 2010 г. № 346н «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации», в частности ст. 72.1 («… в обязательном порядке производится взятие объектов трупа и его частей и направление их для судебно-гистологической экспертизы в случаях наступления смерти в организациях здравоохранения»), ст. 49 («…для проведения лабораторных и (или) инструментальных экспертных исследований из трупа могут быть взяты какие-либо его части, внутренние органы и ткани…»), ст. 50 («…перечень и количество биологических объектов, виды инструментальных и (или) лабораторных исследований определяет эксперт…»).

При выполнении работы с трупным материалом соблюдались определенные требования и условия, изложенные в Федеральном законе «О погребении и похоронном деле» с изменениями от 28 июля 2012г., в частности ст. 5 («Волеизъявление лица о достойном отношении к его телу после смерти…»). Кроме того, при проведении работы были соблюдены определенные требования и условия, изложенные в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (ВМА, 2000г.).

Для исследования характера ультраструктурных изменений основных подтипов митохондрий кардиомиоцитов фрагменты миокарда левого желудочка фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида, приготовленном на среде Хенкса, дофиксировали в 1%-ном растворе ОsO4 на фосфатном буфере (pH=7,4), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм окрашивали толуидиновым синим и изучали под световым микроскопом LEICA DME компании Leica Microsystems AG (Германия). Ультратонкие срезы толщиной 70-100 нм контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе JEM 1400 производства компании JEOL (Япония), в Центре коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН. При увеличении х8000 получали цифровые микрофотографии кардиомиоцитов.

При исследовании ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов выявляли конкретный подтип органелл в соответствии с их локализацией: интермиофибриллярной, субсарколеммальной и перинуклеарной, а также различия органелл по форме и размерам. Для определения формы митохондрий были измерены их диаметры по большой и малой оси. Соотношение диаметров характеризовало степень округлости этих органелл. При величине соотношения диаметров, близкой к 1, митохондрии имели более округлую форму, а при значениях больше 1 – вытянутую форму. Для определения размеров митохондрий находили их площади, используя формулу площади эллипса: S=D1xD2xπ. Кроме того, в программе ImageJ считали и определяли объемную плотность крист митохондрий, используя открытую тестовую систему с шагом 0,1 мкм.

Статистическую обработку проводили, вычисляя значение средней величины и стандартного отклонения. Значимость различий оценивали, используя U-критерий Манна-Уитни, при уровне достоверности 95% (p < 0,05).

Результаты исследования и их обсуждение. Стереологическое морфометрическое изучение основных подтипов митохондрий проводилось в соответствии с их локализацией: перинуклеарных в околоядерной зоне, интермиофибриллярных – в межфибриллярных пространствах и субсарколеммальных – по периферии кардиомиоцитов.

При ультраструктурном анализе органелл отличием перинуклеарных митохондрий являлось их расположение в клетке рядом с ядром кардиомиоцитов, образуя при этом кластеры (рис. А, Б). Морфологически в наблюдениях контрольной группы перинуклеарные митохондрии отличались от двух других подтипов митохондрий меньшими размерами и площадью органелл. В отличие от интермиофибриллярных митохондрий среди перинуклеарных митохондрий не встречались органеллы удлиненной формы.

Морфология подтипов митохондрий в кардиомиоцитах в контрольной группе и при ожоговом шоке. Увеличение х8000.

Перинуклеарные митохондрии (стрелки): А – в контрольной группе; Б – при ожоговом шоке. Субсарколеммальные митохондрии (стрелки): В – в контрольной группе; Г – при ожоговом шоке. Интерфибриллярные митохондрии (стрелки): Д – в контрольной группе; Е – при ожоговом шоке

При ожоговом шоке площадь этого подтипа митохондрий была на 38% достоверно меньше, чем в контрольной группе. Результаты стереологического исследования позволили выявить снижение количества крист перинуклеарных митохондрий на 17% (таблица).

Морфологическая характеристика подтипов митохондрий различной локализации в кардиомиоците (M±SD)

Примечание: Vv – объемная плотность структур (%); n – количество проанализированных митохондрий каждого подтипа в группе; * – отличие от контроля p<0,05.

Субсарколеммальные митохондрии локализовались непосредственно под плазматической мембраной кардиомиоцитов (рис. В, Г). Митохондрии этого подтипа имели округлую или неправильно округлую форму, располагались в виде скоплений органелл по типу цепочек, образуя кластеры клеток. Можно было наблюдать скопление органелл этого типа в участках сближения кардиомиоцитов с кровеносными капиллярами.

В контрольной группе субсарколеммальные митохондрии имели площадь, сходную с интермиофибриллярным подтипом органелл, но при этом данный подтип митохондрий имел более округлую форму, сходную с формой перинуклеарных митохондрий.

При оценке формы и размеров субсарколеммальных митохондрий кардиомиоцитов при ожоговом шоке и в контрольной группе не было выявлено статистически значимых отличий. При изучении структуры крист митохондрий было отмечено статистически значимое снижение их количество на 20% при ожоговом шоке (таблица).

При изучении ультратонких срезов было отмечено, что интермиофибриллярные митохондрии были ориентированы вдоль продольной оси клеток, располагаясь между миофибриллами кардиомиоцитов. Морфологической особенностью этого подтипа митохондрий явилась их более вытянутая между миофибриллами, овальная или цилиндрическая форма, которая в ряде полей могла визуализироваться как несколько прямоугольная (рис. Д, Е).

При оценке особенностей строения трех подтипов органелл контрольной группы интермиофибриллярные митохондрии имели удлиненно овальную форму в сравнении с округлой или овальной формой субсарколемных и перинуклеарных митохондрий.

Сравнительное стереологическое морфометрическое исследование интермиофибриллярных митохондрий кардиомиоцитов при ожоговом шоке позволило выявить более вытянутую форму органелл, в сравнении с этим же подтипом органелл контрольной группы, при этом площадь их не различалась. Изучение особенностей количества крист свидетельствовало о статистически значимом их снижении при ожоговом шоке на 13% (таблица).

На современном этапе исследований ультраструктурной патологии миокарда принято считать, что одними из первых органелл, реагирующих на альтерацию, являются митохондрии [9]. При различной патологии миокарда, в том числе при кардиомиопатиях, отмечают появление в кардиомиоцитах большого количества поврежденных митохондрий с различной выраженностью альтерации [9; 10].

В связи с изложенным становится понятной информативность исследований, направленных на изучение характера ультраструктурных изменений подтипов митохондрий кардиомиоцитов (интермиофибриллярных, субсарколеммальных и перинуклеарных) с учетом их функциональных особенностей в преобразованиях окислительного потенциала, поглощения кальция и митохондриальной проницаемости [10].

Учитывая, что митохондрии имеют собственный геном, митохондриальная ДНК обеспечивает синтез части митохондриальных белков, а репликация митохондрий контролируется ядерной ДНК и объясняет тесный контакт митохондрий с ядром [9], становится важным тот факт, что именно перинуклеарные митохондрии при ожоговом шоке имели более выраженные ультраструктурные изменения, характеризующиеся деструкцией крист и достоверным уменьшением площади этого подтипа органелл. Более выраженные ультраструктурные изменения перинуклеарных митохондрий могут быть связаны с развитием апоптоза клеток.

Наряду с изменениями ультраструктуры перинуклеарных митохондрий заслуживает внимание выявленный, менее выраженный, характер альтеративных изменений интерфибриллярных митохондрий. Вероятно, это связано с филогенетически сформировавшейся толерантностью к повреждающему воздействию именно этого подтипа митохондрий в связи с морфофункциональными особенностями по обеспечению сократительной способности кардиомиоцитов.

Представленные данные могут быть полезны при дальнейшем изучении механизмов, лежащих в основе развития сократительной способности миокарда при патологии органов системы кровообращения [11-13].

Заключение. В результате стереологического морфометрического исследования основных подтипов митохондрий кардиомиоцитов: интерфибриллярных, субсарколеммальных и перинуклеарных, при ожоговом шоке были выявлены ультраструктурные изменения, характеризующиеся статистически значимым снижением количества крист у всех подтипов митохондрий. Наряду с этими изменениями имела место тенденция к изменению формы митохондрий, что может быть связано с набуханием органелл, а также отмечено статистически значимое уменьшение площади перинуклеарных митохондрий.

Ультраструктурные изменения интерфибриллярных митохондрий, отражающие менее выраженное снижение количества крист этого подтипа органелл по сравнению с субсарколеммальными и перинуклеарными органеллами, могут свидетельствовать о большей толерантности этого подтипа митохондрий к альтерации кардиомиоцитов при ожоговом шоке.