В течение ряда лет активно исследуется влияние витаминов на протекание биохимических и физиологических процессов в организме человека. Множество эффектов общеизвестны из доступной литературы, описаны минимальные и рекомендуемые суточные дозы поступления этих химических соединений в организм [1]. Витамины используются в комплексной терапии и профилактике инфекционных заболеваний и коррекции дисбиотических состояний. В то же время, в рамках открывающихся в последние годы сведений о влиянии витаминов на функции микробиома различных биотопов (в первую очередь - микробиома кишечника) [2], важным является изучение воздействия употребляемых человеком витаминов на жизнедеятельность симбионтов, представленных как условно-патогенными, так и патогенными микроорганизмами.
На сегодняшний день является актуальным применение в клинике витаминных препаратов. Как известно, недостаток различных элементов приводит к ослаблению работы иммунной системы, организм становится более подверженным атаке бактерий [3]. Витамины назначают с лечебной целью при некоторых инфекционных заболеваниях внутренних органов, кожных покровов, нервных расстройствах и прочих заболеваниях [4]. Такой витамин, как тиамин, способствует хорошему усвоению белка и участвует во всех клеточных процессах, ретинол оказывает влияние на обменные процессы в организме и обеспечивает здоровый и красивый вид эпидермиса, аскорбиновая кислота активизирует выработку коллагена и повышает защитные функции кожи, токоферол эффективно устраняет раздражение на коже и обеспечивает хорошее заживление ран [5].
Присутствующие в организме хозяина микроорганизмы способны синтезировать разнообразные витамины, необходимые как для организма хозяина, так и для стимуляции роста других микроорганизмов. Витамины также поступают в организм человека с продуктами питания и фармацевтическими препаратами. Выявлена связь дефицита α-токоферола, ретинола ацетата и аскорбиновой кислоты с дефицитом лактофлоры, высокой частотой бактериального вагиноза и кандидоза, изменениями параметров мукозального иммунитета провоспалительной направленности. Доказано нормализующее влияние всех исследуемых витаминов на состояние лактофлоры влагалища, выраженность иммунитета при этом уменьшалась в ряду α-токоферол → ретинола ацетат → аскорбиновая кислота [6].
Проблема влияния витаминов на отдельные патогенные, условно-патогенные и пробиотические штаммы - микроорганизмы, в связи с их широким применением в практической медицине, представляется в настоящее время актуальной и исследуется в различных направлениях. Выявлены значительные изменения антагонистической активности молочнокислых, пропионовокислых бактерий и их ассоциаций под влиянием некоторых витаминов и аминокислот как в сторону увеличения, так и уменьшения. Показано, что испытанные витамины и аминокислоты не оказывают существенного влияния на адгезивную способность большинства тест-культур, но изменяют их резистентность к антибиотикам, причем последняя повышается у патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и снижается у пробиотических микроорганизмов [7].
Витаминные препараты способны воздействовать на персистентный потенциал патогенных и условно-патогенных бактерий, установлено влияние витаминов на ферментативную активность микроорганизмов [8]. Известны способы санации стафилококковых бактерионосителей растворами витаминов А и Е, проявляющих высокое антиоксидантное действие, способствующих репаративным процессам носового эпителия и тормозящих персистентные свойства микроорганизмов [9], что показывает возможность регуляции данного признака бактерий витаминами.
Однако при анализе доступной нам литературы не найдено сведений о влиянии витаминов на такие факторы патогенности микроорганизмов, как гемолитическая и лецитовителлазная активность.
Целью исследования явилось изучение влияния синтетических препаратов-витаминов, используемых в практической медицине, на рост и биологические свойства Staphylococcus aureus и Escherichia coli, представителей микробиома человека.
Материал и методы исследования
Исследования были проведены на 20 штаммах Staphylococcus aureus, выделенных из переднего отдела носовой полости стафилококковых бактерионосителей, обладающих способностью к продукции лецитовителлазы, и 20 штаммах Escherichia coli, проявляющих гемолитическую активность и являющихся представителями микрофлоры кишечника человека (коллекция микробиологической лаборатории Научно-исследовательского центра ОрГМУ).
Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных свойств; биохимический профиль оценивали с помощью тест-систем «STAPHYtest» и «ENTEROtest» фирмы LACHEMA (Чехия). Для характеристики биологических свойств у выделенных микроорганизмов определяли способность к продукции лецитовителлазы, гемолизина и скорость роста.
В работе были использованы разные концентрации коммерческих препаратов-витаминов: тиамин/витамин В1 («Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», Россия) и аскорбиновая кислота/витамин С («Армавирская биологическая фабрика», Россия) - 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 мг/мл; ретинол/витамин А («Марбиофарм» ОАО, Россия) – 100000, 10000, 1000, 100, 10 МЕ/мл; токоферол/витамин Е (ЗАО «ЭКОлаб», Россия) - 100, 10, 0,1, 0,01, 0,001 мг/мл.
Для оценки влияния витаминов на гемолитическую и лецитовителлазную активности ежедневно в течение 12 дней проводили соинкубирование взвеси бактерий с разными концентрациями изученных препаратов в условиях шейкер-инкубатора при 37 °С в течение 60 минут. Затем смесь центрифугировали при 3000 оборотов в минуту, после чего двукратно отмывали клетки физиологическим раствором и проводили посев культуры микроорганизмов на поверхность плотных питательных сред (кровяной и желточный солевой агары). Штаммы E. coli засевали на кровяной агар для оценки гемолитической активности, а штаммы S. aureus - на желточно-солевой агар для оценки лецитовителлазной активности. Чашки инкубировали при температуре 37 °С в течение 16-18 часов с последующим определением наличия и уровня выраженности у выросших бактерий биологических свойств путем замера вокруг колоний зоны гемолиза на чашках с гемолитической активностью и зоны образования перламутрового преципитата - на желточно-солевом агаре. В качестве контроля вместо препаратов использовали изотонический раствор хлорида натрия. Выраженность изменений биологических свойств микроорганизмов определяли как разницу между опытом и контролем в процентном соотношении.
Во второй серии опытов было изучено влияние разных концентраций витаминов на динамику роста путем культивирования исследуемых микроорганизмов в периодической культуре на жидкой питательной среде как в присутствии разных концентраций витаминов, так и без добавления препаратов. Оптическую плотность измеряли с помощью портативного микрострипового фотометра STAT FAX 303 Plus при длине волны 570 нм. Производили измерение оптической плотности через каждые 3 часа. Изучение влияния витаминов разных концентраций на динамику роста исследуемых штаммов осуществлялось путем определения разницы оптической плотности между опытом и контролем в процентном соотношении.
Все эксперименты проводили в двух сериях при трехкратном воспроизведении. Статистическая обработка результатов исследований проводилась с использованием программ Excel, StatPlus v5 согласно «Методическим указаниям по статистической обработке результатов доклинических исследований» [10].
Результаты исследования и их обсуждение
В первой серии опытов было установлено разнонаправленное действие витаминов на лецитовителлазную активность, являющуюся одним из факторов патогенности стафилококков. При изучении модифицирующего влияния токоферола на лецитовителлазную активность S. aureus отмечалось уменьшение выраженности признака в ряду 100 мг/мл (на 20+8,9%)> 10 мг/мл (на 20+8,9%)> 0,1 мг/мл (на 40+10,9 %)> 0,01 мг/мл (на 60+10,9 %)> 0,001 мг/мл (на 60+10,9%). Под влиянием разных концентраций витамина А происходила модификация продукции лецитовителлазы в зависимости от концентрации препарата: при концентрации 100000 МЕ/мл наблюдалась стимуляция продукции фермента на 20+8,9% от уровня контроля, тогда как при концентрациях 10000, 1000, 100, 10 МЕ/мл лецитовителлазная активность снижалась, но в меньшей степени, чем под влиянием витамина Е (максимально на 40+10,9%). Экспрессия лецитовителлазной активности S. aureus под влиянием разных концентраций витамина С показала стабильное снижение в ряду 10000 МЕ/мл (на 20+8,9%)> 1000 МЕ/мл (на 40+10,9%)> 100МЕ/мл (на 60+10,9%)> 10 МЕ/мл (на 80+8,9%), тогда как концентрация 100000 МЕ/мл не оказывала влияние на первоначальный уровень признака. Ингибирование у стафилококков изученного признака происходило и под влиянием тиамина, но при этом наблюдался обратный дозозависимый эффект: при концентрациях препарата 0,005 и 0,05 мг/мл снижение отмечено на 40+10,9%; при концентрациях препарата 0,5, 5 и 50 мг/мл - на 80+8,9% от уровня контроля.
Для исследования влияния витаминов на патогенный потенциал E. coli была выбрана гемолитическая активность. Изучение регулирующего действия витамина Е на кишечную палочку показало, что происходила модификация продукции гемолизина в 1,5-2,0 раза при высоких концентрациях препарата (в концентрации 100, 10 и 0,1 мг/мл), тогда как при концентрациях 0,01 и 0,001 мг/мл уровень изученного признака не изменялся. Анализ модифицирующего эффекта витамина А на гемолитическую активность E. coli показал, что действие препарата приводит как к стимуляции, так и ингибированию изученного признака: при концентрациях 1000, 100, 10 МЕ/мл уровень признака возрастал на 20+8,9% - 30+10,2%, тогда как при концентрации 10000 МЕ/мл наблюдалось снижение продукции гемолизина на 50+11,2% от исходного уровня вплоть до полного его исчезновения при максимальной концентрации в 100000 МЕ/мл. Под влиянием разных концентраций витамина С на E. coli отмечалось увеличение продукции гемолизина 1,5-3,5 раза в ряду 50 мг/мл> 5 мг/мл> 0,5 мг/мл> 0,05 мг/мл, тогда как при минимальном разведении препарата (0,005 мг/мл) уровень изученного признака не изменялся. При изучении действия витамина В1 эффект влияния препарата на продукцию гемолизинов E. coli варьировал от стимуляции признака в 0,6 – 2,5 раза (при концентрациях 5, 0,5, 0,05 мг/мл) до угнетения (при концентрации витамина 50 мг/мл) на 50+11,2% от контрольного уровня. Под действием витамина В1 в концентрации 0,005 мг/мл значение признака не изменилось.
Во второй серии опытов оценивали динамику роста микроорганизмов, измеряя оптическую плотность бульонной культуры с добавлением разных концентраций изученных витаминов. В результате исследования влияния препаратов на динамику роста S. aureus было установлено, что все концентрации тиамина, аскорбиновой кислоты и токоферола оказывали ингибирующее действие на скорость роста и размножения данного микроорганизма. Причем наиболее выраженным данный эффект был в экспоненциальной фазе роста бактерий при более высоких концентрациях препаратов: при концентрациях тиамина 0,5 и 5 мг/мл снижение произошло на 12,5+7,4%; при концентрациях аскорбиновой кислоты 50 мг/мл - на 43,0+11,1%; при концентрациях токоферола 100 мг/мл - на 16,0+8,2% от уровня контроля. Изучение регулирующего действия ретинола показало, что витамин А, наоборот, в максимальной концентрации стимулировал ростовые характеристики стафилококков: при высокой концентрации ретинола 100000 МЕ/мл скорость роста S. aureus была выше на 21,5+9,1% по сравнению с контролем.
Анализ результатов исследования влияния препаратов на динамику роста E. coli показал, что все концентрации тиамина, аскорбиновой кислоты и токоферола не оказывали модифицирующего действия на скорость роста и размножения данного микроорганизма, кроме витамина А, который при концентрации 100000 МЕ/мл увеличивал скорость роста популяции на 10,7+6,9% по сравнению с контрольной пробой.
В результате проведенных исследований получены новые знания по модифицирующему действию исследованных витаминов на гемолитическую и лецитовителлазную активности микроорганизмов, которые показали, что разные концентрации витаминов неоднозначно влияют на уровень выраженности биологических характеристик изученных штаммов микроорганизмов и оказывают в некоторых случаях стимулирующий, а в других – ингибирующий эффекты. Исследование выявило, что высокие дозы тиамина оказывают ингибирующее влияние на гемолитическую активность E. coli и лецитовителлазную активность S.aureus. Выявленный эффект воздействия витамина В1 на микроорганизмы может расширить спектр его биологических свойств, а возможно и применения.
В работе было показано, что высокая концентрация ретинола оказывала тормозящее влияние на гемолитическую активность E. coli и стимулирующий эффект - на лецитовителлазную способность S.aureus и скорость роста изученных микроорганизмов. Интересен тот факт, что такие витамины, как тиамин, аскорбиновая кислота и токоферол, проявляли ингибирующее действие во всех изученных концентрациях на скорость роста микроорганизмов.
Влияние ретинола на рост и свойства микроорганизмов согласуются с некоторыми известными данными. Установлена способность витамина А в суббактериостатических концентрациях снижать персистентные свойства стафилококков, в частности антилизоцимную активность, дающую патогену преимущества в биоценозе. Описано, что ретинол может подавлять персистентные свойства стафилококков и способствовать заживлению слизистой оболочки носовой полости. Это свойство ретинола, вместе с его способностью усиливать регенерацию тканей, было положено в основу метода санации стафилококковых бактерионосителей [11].
Полученные авторами данные о влиянии отдельных витаминов на факторы персистенции эндогенной и транзиторной микрофлоры иллюстрируют новые возможные механизмы регуляции симбиотических взаимоотношений. Регулирующее действие витаминов на качественный и количественный состав микрофлоры может быть объяснено не только подавлением роста отдельный групп бактерий в условиях действия определенных витаминов, но и влиянием данных биологически активных соединений на факторы персистенции и вирулентности микроорганизмов.
Практический интерес также могут представлять полученные в ходе эксперимента данные о дозозависимом эффекте влияния одного и того же витамина на экспрессию факторов вирулентности (гемолитическую и лецитовителлазную активности) и скорость роста Staphylococcus aureus и Escherichia coli, представителей микробиома человека, что может быть связано с антиоксидантной или прооксидантной активностью препаратов.
Таким образом, полученные данные об эффектах воздействия разных концентраций витаминов на биологические характеристики микроорганизмов представляют интерес, поскольку изменение степени выраженности биологических свойств бактерий, представителей микробиоты человека, обосновывают целесообразность комплексного изучения витаминов не только в качестве перспективы борьбы с патогенными штаммами, но и как препаратов для стимуляции роста представителей собственной нормофлоры.
Заключение
Результаты экспериментов еще раз свидетельствуют о том, что витамины могут рассматриваться как важнейшая группа биологически активных веществ для использования в лечении заболеваний микробной этиологии, в частности дисбиотических состояний.
Рассматривая витамины в качестве препаратов для коррекции биоценозов различных биотопов, необходимо оценивать их эффект с учетом допустимой концентрации in vivo, возможного разнонаправленного действия на патогены и представителей эндогенной флоры биотопа, а также принимать во внимание сочетанное влияние витаминных комплексов на представителей микробиома человека.
Научные исследования выполнены по проекту «Технологиярационального применения лекарственныхпрепаратов, избирательно подавляющих факторы вирулентности микроорганизмов» НИР в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации на 2018-2020 годы.