Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF POLYHEXAMETHYLENE GUANIDINE PHOSPHATE DEPENDING ON ITS PRODUCTION TECHNOLOGY

Lepekhova S.A. 1 Stankevich V.K. 1 Koval E.V. 1 Grigorev G.E. 1 Inozemtsev P.O. 1 Belozerov L.E. 2 Shelupaev A.P. 1
1 Irkutsk Scientific Center of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences
2 A.E. Favorsky Irkutsk Institute of the Chemistry, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences
Guanidine derivatives are widely used for the production of disinfectants and skin antiseptics used in medicine and are promising means, however, there is no consensus on the technology, preparation of compounds for their standardization. Comparison of the antibacterial activity of polyhexamethylene guanidine phosphate obtained using various technologies. Bench tests in vitro were performed to select the lowest concentration of samples with high antimicrobial activity against E. coli strain 109 CFU / ml and mixed E. coli + Ps. Aeruginosa 109 CFU / ml. We used two series of polyhexamethylene guanidine phosphate obtained using various production technologies. A solution of chlorhexidine bicluconate of various concentrations was used as a reference solution. E. coli and Ps. aeruginosa were kept on solid nutrient media with periodic passaging on enrichment media in a thermostat at 37°C for 18–24 hours. The experimental data were statistically processed using the Statistica 10.0 software. Results. The best results were achieved when exposed to an aqueous solution of sample 2, which was obtained from a dry water-soluble substance obtained by polycondensation of hexamethylenediamine with guanidine carbonate in the presence of an organic solvent and the subsequent formation of a phosphoric acid salt in comparison with the antibacterial activity of sample 1, obtained by fusing the starting materials. Its use in low concentrations of up to 0.0015% for mixed infections can reliably reduce the number of E. coli from 109 to zero, and Ps. aeruginosa from 109 to 103 CFU / ml (pu0.05). Polyhexamethylene guanidine phosphate obtained by polycondensation of hexamethylenediamine with guanidine carbonate in the presence of an organic solvent and subsequent treatment of the intermediate product with phosphoric acid in water, has a higher antibacterial activity compared to polyhexamethylene guanidine obtained by fusion technology.
antiseptics
antibacterial activity
technology

Применение антисептиков актуально в связи с широким распространением новых инфекций и ростом антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов. В настоящее время при пандемии коронавирусной инфекции эта проблема приобретает глобальный характер [1-4].

Перспективные антисептики должны быть универсальными, одновременно разрушать вирулентную грамположительную и грамотрицательную микрофлору, вирусы, дрожжеподобную, плесневую, грибковую флору. В фармакологическом смысле перспективные антисептики должны обладать избирательной токсичностью – быть ядами в отношении микроорганизмов и малотоксичными для теплокровных животных. Гуанидинпроизводные соединения широко используются для производства дезинфицирующих средств и кожных антисептиков, применяемых в медицине, различных отраслях промышленности и в быту, являются перспективными средствами для проведения текущей уборки, обработки поверхностей. Некоторые авторы отмечают усиление антимикробной активности антибактериальных препаратов при использовании их совместно с антисептиками на основе гуанидинпроизводных соединений, комплексных соединений [5-7].

Полигексаметиленгуанидин фосфат, полученный по щадящей технологии в среде органического растворителя, рекомендован как дезинфектант. Ведутся работы по изучению возможности использования гуанидинпроизводных для лечения инфицированных ран [8, 9].

Несмотря на большой интерес к данной группе соединений, остается открытым вопрос оптимальной технологии производства, подготовки, стандартизации, формы выпуска и использования, с максимальным выходом действующего вещества с высокой антибактериальной активностью.

Целью нашего исследования было сравнение антибактериальной активности полигексаметиленгуанидин фосфата, полученного с использованием различных технологий, для подбора наименьшей концентрации образцов с высокой антимикробной активностью в отношении штамма E. coli 109 КОЕ/мл и микста E. coli + Ps. aeruginosa 109 КОЕ/мл.

Материалы и методы исследования. В работе использовали водные растворы гуанидинпроизводных соединений: 2 образца полигексаметиленгуанидин фосфата, полученных по разным технологиям.

Образец 2 был получен из сухого водорастворимого вещества

в качестве препарата сравнения применяли хлоргексидина биглюконат. Исследования in vitro в виде стендовых опытов c применением метода серийных разведений в жидких средах выполнены для подбора наименьшей концентрации образцов с высокой антимикробной активностью в отношении штамма E. coli 109 КОЕ/мл и микста E. coli + Ps. aeruginosa 109 КОЕ/мл. Использовали следующие концентрации водных растворов образца 1 и образца 2, а также хлоргексидина биглюконата: 0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01%, 0,005%, 0,003%, 0,0015%, 0,001%. Культуры E. coli и Ps. aeruginosa сохраняли на твердых питательных средах с периодическим пассированием на средах обогащения в термостате при температуре 37°С в течение 18–24 ч. Полученную культуру смывали теплым стерильным раствором натрия хлорида и стандартизировали до 109 КОЕ в миллилитре (КОЕ/мл) по стандарту мутности (Методика Института стандартизации и контроля биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, Москва) [10].

Все экспериментальные данные исследований были статистически обработаны с использованием программы Statistica 10.0 (лицензия № AXAR402G263414FA-V). Определение значимости различий полученных данных (р) в сравниваемых выборках проведено с использованием непараметрических методов (критерий Манна–Уитни (U), критерий Вилкоксона (W)) [11].

Результаты исследования и их обсуждение. Для сравнительной оценки антибактериальной активности были взяты водные растворы двух образцов, полученных по различным технологиям, и известный антисептик хлоргексидина биглюконат.

По одному из способов полигексаметиленгуанидин фосфат (образец 1) получен сплавлением карбоната гуанидина с гексаметилендиамином при температуре 135–145оС в течение 10–15 ч с последующим взаимодействием тщательно измельченного получившегося твердого полигексаметиленгуанидин карбоната с ортофосфорной кислотой [12] .

По второй технологии полигексаметиленгуанидин фосфат получен взаимодействием гексаметилендиамина с карбонатом гуанидина, которое проводили при температуре 110–145°С в присутствии органического растворителя, способного к образованию гетероазеотропных смесей с водой, с последующей обработкой промежуточного продукта (в этом же реакторе) фосфорной кислотой в среде воды. Технология позволяет нарабатывать сухую субстанцию, из которой в дальнейшем готовили водный раствор (образец 2) [8].

Далее было проведено стендовое исследование по подбору минимальной концентрации образцов с антибактериальной активностью в отношении госпитального, антибиотикорезистентного штамма E. сoli 109 КОЕ/мл in vitro.

Динамика уровня КОЕ/мл в зависимости от концентрации, представлена в таблице 1.

Таблица 1

Антибактериальная активность различных концентраций образцов в опытах in vitro

Бактерии, конц.

Концентрация
антисептика

Антисептик

Бактериальный рост

E. coli

109

 

0,1%

Образец 1

0

Образец 2

0

Хлоргексидина биглюконат

0

0,05%

Образец 1

0

Образец 2

0

Хлоргексидина биглюконат

0

0,02%

Образец 1

0

Образец 2

0

Хлоргексидина биглюконат

0

0, 01%

Образец 1

0

Образец 2

0

Хлоргексидина биглюконат

0

0,005%

Образец 1

0

Образец 2

0

Хлоргексидина биглюконат

0

0,003%

Образец 1

0

Образец 2

0

Хлоргексидина биглюконат

0

0,0015%

Образец 1

0

Образец 2

0

Хлоргексидина биглюконат

0

0,001%

Образец 1

105

Образец 2

103

Хлоргексидина биглюконат

104

 

Концентрации 0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01%, 0,005%, 0,003%, 0,0015% водных растворов образцов 1, 2 и водного раствора хлоргексидина биглюконата снижали количество микроорганизмов с 109 E. сoli КОЕ/мл до нулевой величины, пробы становились стерильными. Концентрация образцов 0,001% переставала подавлять рост микроорганизмов. Отметим, что при добавлении образца 2 количество E. сoli достоверно снижалось с 109 до 103 КОЕ/мл (pU≤0,05); водного раствора хлоргексидина биглюконата – до 104 КОЕ/мл, образца 1 – до 105 КОЕ/мл. Следует отметить, что водный раствор 0,001% образца 2 подавлял рост микроорганизмов более эффективно, чем водный раствор 0,001% хлоргексидина биглюконата (pU=0,003) и образца 1 (pU=0,002).

Для выявления антибактериальной активности образцов в отношении микста E. coli + Ps. aeruginosa был выполнен следующий стендовый эксперимент, результаты которого представлены в таблице 2.

Таблица 2

Антибактериальная активность различных концентраций образцов в опытах in vitro

Бактерии, конц.

Концентрация антисептика

Антисептик

Бактериальный рост

E. сoli / Ps. Aer.

E. coli

109

+

Ps.

aeruginosa

109

 

0,1%

Образец 1

0 / 0

Образец 2

0 / 0

Хлоргексидина биглюконат

0 / 0

0,05%

Образец 1

0 / 0

Образец 2

0 / 0

Хлоргексидина биглюконат

0 / 0

0,02%

Образец 1

0 / 0

Образец 2

0 / 0

Хлоргексидина биглюконат

0 / 0

0, 01%

Образец 1

0 / 0

Образец 2

0 / 0

Хлоргексидина биглюконат

0 / 0

0,005%

Образец 1

0 / 0

Образец 2

0 / 0

Хлоргексидина биглюконат

0 / 0

0,003%

Образец 1

0 / 0

Образец 2

0 / 0

Хлоргексидина биглюконат

0 / 0

0,0015%

Образец 1

103 / 103

Образец 2

0 / 103

Хлоргексидина биглюконат

103 / 104

0,001%

Образец 1

105 / 105

Образец 2

103 /103

Хлоргексидина биглюконат

103 / 105

 

Динамика уровня КОЕ/мл в зависимости от концентрации 0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01%, 0,005%, 0,003% водного раствора образцов 1, 2 и хлоргексидина биглюконата выявила существенное снижение количества микроорганизмов с 109 до нулевой величины КОЕ/мл, пробы становились стерильными.

Нами показано, что при концентрации антисептиков 0,0015% и 0,001% отмечается рост микроорганизмов. Использование водного раствора 0,0015% образца 2 позволяет достоверно снизить количество E. coli с 109 до нулевой величины, а Ps. aeruginosa – с 109 до 103 КОЕ/мл (pU≤0,05). Водный раствор хлоргексидина биглюконата в концентрации 0,0015% снижает количество E. coli с 109 до 103, а Ps. aeruginosa – с 109 до 104 КОЕ/мл (pU≤0,05), образец 1 в концентрации 0,0015% снижает количество E. coli с 109 до 103, а Ps. aeruginosa – с 109 до 103 КОЕ/мл (pU≤0,05).

Следует отметить, что образец 2, полученный по второй технологии, подавлял рост микроорганизмов более эффективно, чем образец 1 и хлоргексидина биглюконат (pU≤0,05). Дальнейшее снижение концентрации приводит к увеличению бактериальной контаминации.

На основании стендовых экспериментов нами выявлена высокая антибактериальная активность водного раствора образца 2, полученного с использованием второй технологии, где полигексаметиленгуанидина фосфат получается поликонденсацией гексаметилендиамина с карбонатом гуанидина в среде органического растворителя и последующим образованием соли фосфорной кислоты, в отношении госпитального штамма E. сoli и микста Ps. аeruginosa + E. сoli в очень низких концентрациях (до 0,0015%).

Заключение

Таким образом, сравнительная оценка антибактериальной активности водных растворов образцов гуанидинпроизводных соединений, полученных по различным технологиям, выявила, что наилучшие результаты были достигнуты при воздействии водного раствора образца 2, который был получен из сухого водорастворимого вещества, полученного поликонденсацией гексаметилендиамина с карбонатом гуанидина в присутствии органического растворителя и последующей обработкой промежуточного продукта фосфорной кислотой в среде воды. Его использование в очень низких концентрациях (до 0,0015%) позволяет достоверно снизить количество E. coli с 109 до нулевой величины, а Ps. aeruginosa – с 109 до 103 КОЕ/мл (pU≤0,05) при использовании микст-инфекции. Образец 1, полученный сплавлением карбоната гуанидина с гексаметилендиамином при температуре 135–145оС в течение 10–15 ч, с последующим взаимодействием измельченного получившегося твердого полигексаметиленгуанидин карбоната с ортофосфорной кислотой, и антисептик хлоргексидина биглюконат в концентрации 0,0015% снижали количество E. coli и Ps. aeruginosa в миксте, но менее эффективно, чем образец 2 (pU≤0,05).