Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ASSOCIATION OF DRB1, DQA1, DQB GENES OF THE HLA II CLASS SYSTEM WITH RISK OF DEVELOPMENT OF TYPE 1 DIABETES MELLITUS IN THE YAKUT POPULATION

Soloveva N.A. 1 Kurtanov K.A. 1 Pavlova N.I. 1 Dyakonova A.T. 1 Filippova N.P. 1 Aleksandrova T.N. 1
1 Yakut science center of complex medical problems
The article presents the results of a molecular genetic study conducted using the typing of HLA class II genes (DRB1, DQA1, DQB1). 92 DNA samples of patients with a confirmed diagnosis of type 1 diabetes mellitus, aged 4 to 56 years, residing in the Sakha Republic (Yakutia) were analyzed. The population sample consisted of 210 individuals with no signs of type 1 diabetes. All study participants were Yakuts. Ethnicity of the study participants was taken into account until the third generation. The study was conducted with the written consent of the participants, for participants under the age of 18 - the consent was signed by the parents. As a result of a molecular genetic study of patients with type 1 diabetes mellitus, the three most significant haplotypes associated with the risk of developing this disease were identified. The maximum RR value was set for DR3 / X-4.234 haplotype, its value for DRB1 * 04: 01 – DQA1 * 03: 01-DQB1 * 03: 02 (DR4-DQ8) haplotype was 3.917, and for the DRB1 * 03-haplotype DQA1 * 05: 01-DQB1 * 02: 01. The value of RR was 3.763. Thus, the obtained results can be used as unfavorable markers in predicting the risks of predisposition to type 1 diabetes in the Yakut population.
hla class ii genes
type 1 diabetes mellitus
polymorphism
yakuts

Сахарный диабет 1-го типа (СД 1-го типа) является многофакторным заболеванием, обусловленным взаимодействием генетических и средовых факторов. Поиск генов, демонстрирующих ассоциацию с СД 1-го типа, необходим для более точного понимания механизмов развития заболевания и разработки доклинической диагностики с целью профилактики заболевания. На сегодняшний день убедительно доказана роль большого числа генов в развитии СД 1-го типа [1]. Установлено, что значительная доля генетических рисков для этого заболевания связана с полиморфными вариантами генов системы HLA, расположенных на коротком плече хромосомы 6 (6p21). Исследованиями продемонстрировано, что наиболее значимый вклад в предрасположенность к развитию СД 1-го типа вносят гены системы HLA 2-го класса главного комплекса гистосовместимости человека, в особенности гены DR и DQ, усиливающие взаимное влияние [2, 3, 4].

Анализ гаплотипов, предрасполагающих к развитию СД 1-го типа в европейских популяциях, включая российскую, продемонстрировал наибольшую значимость для 2 гаплотипов – DRB1*O4-DQA1*O3O1-DQB1*O3O2 и DRB1*O3-DQA1*O5O1-DQB1*O201, обозначаемых как DQ2 и DQ8. Результатами некоторых исследований показано, что полиморфизм генов HLA может носить протективную роль [4, 5]. Кроме того, отмечено, что гены системы HLA могут участвовать в формировании таких клинических особенностей болезни, как возраст начала болезни или исход активного клеточного аутоиммунитета. Так, комбинация гаплотипов DR3 и DR4 не только предрасполагает к развитию СД 1-го типа, но и влияет на возраст начала болезни. Данная комбинация гаплотипов встречается значимо чаще в группе пациентов с началом СД 1-го типа в раннем детстве [6]. Анализ частот генотипов высокого риска DQ2/DQ8 в русской популяции продемонстрировал их преобладание у детей, заболевших до пятилетнего возраста (33%), по сравнению с детьми, у которых СД 1-го типа манифестировал в возрасте старше 10 лет (23%) [7].

Оценка аллельных сочетаний генов системы HLA установила, что они способны по-разному влиять на риск развития СД 1-го типа. Так, высокая степень риска была установлена для HLA-DRB1*03 (DR3) и HLA-DRB1*04(DR4), причем наиболее высокий риск отмечался у лиц с гетерозиготным генотипом DQA1*05:01-DQB1*02:01(DQ2), DQA1*03-DQB1*03:01 (DQ8). Кроме того, было установлено, что некоторые аллельные сочетания характеризовались протективным действием по отношению к развитию диабета (например, аллель HLA-DRB1*04 (DR4) в сочетании с DQA1*03-DQB1*03:01 (DQ7) образуют гаплотип, ассоциированный c низким риском развития СД 1-го типа) [8, 9].

Целью настоящего исследования было определение этнических особенностей вариантов генов HLA-DR и HLA-DQ, ассоциированных с сахарным диабетом 1-го типа, в популяции якутов посредством изучения молекулярной структуры и распространенности гаплотипов в локусе HLA.

Материалы и методы исследования

В исследование были включены участники, не имеющие родственных связей и добровольно подписавшие информированное согласие на проведение генетического исследования; для участников, не достигших совершеннолетия, информированное согласие подписывали родители.

Для каждого участника исследования была разработана индивидуальная генетическая карта, содержащая клинико-функциональные и лабораторные показатели, а также генеалогические данные участника. Каждому участнику был присвоен идентификационный номер и создан регистр участников исследования.

Все больные прошли тщательное медицинское обследование врачами-эндокринологами больницы ФГБНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем», ГАУ РС(Я) РБ № 1 НЦМ Педиатрический центр и эндокринологического отделения ГБУ РС(Я) «Якутская городская клиническая больница» г. Якутска. При дифференциации диагноза пользовались классификацией, одобренной Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ, 1999), и рекомендациями Американской диабетической ассоциации (2010).

Экспериментальная часть работ по генотипированию аллелей HLA DRB1 и DQB1 была проведена в лаборатории наследственной патологии отдела молекулярной генетики Якутского научного центра комплексных медицинских проблем (ЯНЦ КМП). Для исследования использовались образцы ДНК из коллекции биоматериала ЯНЦ КМП с использованием УНУ «Геном Якутии» (рег. № USU_507512). Выборка состояла из 92 пациентов больницы ФГБНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем», ГАУ РС(Я) РБ № 1 НЦМ Педиатрический центр и эндокринологического отделения ГБУ РС (Я) «Якутская городская клиническая больница» г. Якутска. Все пациенты имели диагноз СД 1-го типа, возраст от 4 лет до 56 лет, проживали в РС (Я) и являлись якутами по этнической принадлежности. В число пациентов вошли 44 (47,8 %) мужчины и 48 женщин. Средний возраст пациентов составил 23,04±0,27 года, средний возраст пациентов мужского пола – 20,5±2,3 года (от 5 до 40 лет), женского пола – 25,11±2,59 года (от 4 до 56 лет). Популяционную выборку составили 210 якутов, не страдающих СД 1-го типа. Этническая принадлежность учитывалась до третьего поколения.

Генотипирование аллелей HLA DRB1 и DQB1 проведено коммерческими наборами HISTOTYPE, прогенотипированы HLA аллели DRB1*03:01 (DR3), DRB1*04:01 (DR4), DQB1*02:01 (DQ2), DQA1*05:01.

Параметры амплификации оптимизировались на общий объем реакционной смеси – 10 мкл. ПЦР проводили в соответствии с инструкциями изготовителя в термоциклере MJ Mini Gradient Thermal Cycler (BioRad) (табл. 1).

Таблица 1

Температурная программа амплификации набором HISTOTYPE

Шаги

Температура

Время

Количество циклов

Первая денатурация

96°C

5 минут

1 цикл

Денатурация

96°C

20 секунд

5 циклов

Отжиг и элонгация

68°C

1 минута

Денатурация

96°C

20 секунд

10 циклов

Отжиг

64°C

50 секунд

Элонгация

72°C

45 секунд

Денатурация

96°C

20 секунд

15 циклов

Отжиг

61°C

50 секунд

Элонгация

72°C

45 секунд

Заключительная элонгация

72°C

5 минут

1 цикл

 

Результаты амплификации фракционировали в 2%-ном агарозном геле с бромистым этидием при напряжении 120–300 В в течение 45–120 минут. Документирование и визуализацию ПЦР-амплификата проводили посредством фотографирования в UV-свете с помощью гель-документирующего прибора VilbеrLourmat (рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма продукта амплификации HLA DRB1 и DQB1 в 2%-ном агарозном геле (генотипирование HLA DRB1 и DQB1 с помощью коммерческих наборов HISTO TYPE). Примечание: п.н. – пар нуклеотидов. 1 – DRB1*03 (220 п.н.); 2 – DRB1*04 (200 п.н.); 3 – DQB1*02:01 (800 п.н.); 4 – DQB1*02:02 (150 п.н.); 5 – DQA1*05:01 (235 п.н.). Внутренний контроль: 1070 п.н. (1, 2, 4, 5) и 429 п.н. (3). 6 – ДНК маркер «Step100»

Интерпретация результатов генотипирования по наборам HISTOTYPE проводилась на основании диаграммы оценки (обновлен 01/2015_3.19.0 (6.2)): для HISTOTYPE специфические бэнды имеют размер 220, 200, 800, 150 и 235 п.н. Во всех дорожках без аллель-специфического амплификата должен быть четко виден внутренний контроль размером 429 или 1070 п.н. Оценка бэндов проводилась с помощью ДНК маркер «Step 100» (ООО «Биолабмикс», г. Новосибирск, Россия).

Для получения основных показателей внутрипопуляционной изменчивости использовали программу статистической обработки «SPSS –Statistical Package for the Social Sciences» версии 27.

При анализе сопряженности частоты неблагоприятного аллеля с СД 1-го типа использовали четырехпольную таблицу сопряженности (табл. 2).

Таблица 2

Четырехпольная таблица сопряженности

 

Больные СД 1-го типа

Контрольная выборка

Всего

Аллель риска

A

B

A + B

Аллель риска отсутствует

C

D

C + D

Всего

A + C

B + D

A + B + C + D

 

Для расчета относительного риска использовали четырехпольную таблицу сопряженности и следующую формулу:

где RR – относительный риск; A, B, C, D – количество наблюдений в ячейках таблицы сопряженности.

Для оценки значимости относительного риска рассчитывались границы 95%-ного доверительного интервала (95% ДИ, или 95% CI, от англ. confidenceinterval). Результаты считались значимыми при p<0,05.

Результаты исследования и обсуждение

Результаты оценки частот распределения ключевых гаплотипов генов системы HLA II класса, ассоциированных с развитием СД 1-го типа, представлены в таблице 3. По результатам молекулярно-генетического исследования больных СД 1-го типа выявлены три наиболее значимых гаплотипа, ассоциированных с риском развития заболевания.

Таблица 3

Частота встречаемости гаплотипов в группе больных СД 1-го типа и контрольной выборке

Гаплотипы и генотипы по генам HLA

Частота в группе больных СД 1 типа, абс.

pi±spi

Частота в контрольной группе, абс.

pi±spi

RR

( DI 95 )

р

1.

DRB1*03:01-DQA1*05:01-DQB1*02:01

16

17,4±2,8

0

-

3,763

(3,104 – 4,563)

<0,001

2.

DRB1*04:01–DQA1*03:01-DQB1*03:02 (DR4-DQ8)

20

21,8±3,0

0

-

3,917

(3,209 – 4,781)

<0,001

3.

DR3/4-DQ8

6

6,5±1,8

2

0,95±0,47

2,564

(1,655 – 3,972)

0,018

4.

DR3/X

42

45,6±3,7

8

3,8±0,93

4,234

(3,212 – 5,580)

<0,001

5.

DRB1*04:01-DQA1*03:01-DQB1*03:01 (DR4-DQ7)

0

-

132

62,85±2,4

0,000

<0,001

6.

DRX/X

8

8,7±2,1

68

32,4±2,3

0,283

(0,144-0,557)

<0,001

Примечание: DRX/X – отсутствие как DR3, так и DR4; DR3/Х – вариант носительства 1-го типа DR3 и типа DR3, не относящегося к DR4, pi – частота встречаемости гаплотипа, s – ошибка частоты

Максимальное значение RR было установлено для гаплотипа DR3/X – 4,234, его значение для гаплотипа DRB1*04:01–DQA1*03:01-DQB1*03:02(DR4-DQ8) составило 3,917 и для гаплотипа DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01 оно составило 3,763 (рис. 2).

Рис. 2. Распределение частот гаплотипов генов HLA среди больных СД 1-го типа и контрольной группы

Полученные результаты согласовываются с литературными данными – порядка 90% пациентов СД 1-го типа характеризуются носительством HLA-DR3, DQB1*0201 (DR3-DQ2) или DR4, DQB1*0302 (DR4-DQ8). Для 30% пациентов характерно носительство комбинированного генотипа DR3/4, ассоциированного с наибольшей восприимчивостью к заболеванию [10]. Результаты сравнительного анализа частот распределения предрасполагающих аллелей среди якутской популяции и русской популяции г. Москвы показали, что в якутской популяции среди больных СД 1-го типа чаще встречаются аллели DRB1*04 и DRB1*17(03). Авторами также было показано, что DRB1*17(03) в якутской популяции является самым сильным предрасполагающим аллелем (RR=8,47), а в московской популяции – DQB1*03:04 (RR =8,94) [5].

В контрольной группе достоверно чаще выявлялся гаплотип DRB1*04:01-DQA1*03:01-DQB1*03:01 (DR4-DQ7) – 62,85±2,4, ассоциированный ранее с низким риском развития заболевания [9].

Заключение

По результатам молекулярно-генетического исследования больных СД 1-го типа выявлены три наиболее значимых гаплотипа, ассоциированных с риском развития заболевания. Так, значение RR для гаплотипа DR3/X составило 4,234, для гаплотипа DRB1*04:01–DQA1*03:01-DQB1*03:02 (DR4-DQ8) составило 3,917 и для гаплотипа DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01 составило 3,763. Полученные результаты могут быть использованы в качестве неблагоприятных маркеров при прогнозировании рисков предрасположенности к сахарному диабету 1-го типа в популяции якутов.

Исследование было проведено в рамках НИР Изучение генетической структуры и груза наследственной патологии популяций Республики Саха (Якутия).