Псориаз – аутоиммунное заболевание мультифакториального генеза с рецидивирующим течением, многообразием фенотипов, клинических разновидностей и возможным выявлением различных коморбидностей псориаза [1]. По данным литературы, распространенность псориаза во всем мире составляет 4–7% [2]. Первичную высокую эффективность представляют топические кортикостероиды. Однако местные кортикостероиды не показаны для длительной и постоянной фармакотерапии, что предполагает внедрение ротационных схем ввиду того, что длительное применение может приводить к угнетению функций надпочечников, атрофии кожи и развитию других побочных эффектов [1; 3, с. 38]. Из арсенала наружных антипсориатических средств особого внимания заслуживает комбинация кальципотриола и бетаметазона (Дайвобет), эффективность которой обусловлена синергичным действием ее компонентов на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов и на иммуновоспалительный процесс в коже при псориазе [4, с. 16]. Однако низкая эффективность монотерапии требует сочетанного применения топических кортикостероидов. Кроме того, в эксперименте на крысах показано, что препарат повышает чувствительность к ультрафиолетовым лучам и способствует развитию опухолей кожи.
Лекарственные растения по-прежнему являются безопасным, менее токсичным и доступным источником лекарственных средств во всем мире. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) считает, что 80% азиатских и африканских стран в настоящее время используют фитотерапию для некоторых аспектов первичной медико-санитарной помощи [5, с. 997]. Многочисленные клинические наблюдения, в том числе и данные народной медицины, свидетельствуют о высокой эффективности фитопрепаратов в лечении псориаза. Так, показана клиническая эффективность комплексного фитопрепарата на основе Commiphora mukul и Psoralea corilyfolia с меньшими побочными эффектами по сравнению с синтетическими препаратами, используемыми при лечении псориаза [6, с. 335]. Применение экстракта Medicago sativa внутрь и наружно на фоне стандартной терапии у больных вульгарным псориазом способствует некоторому снижению цитолитического и холестатического синдромов, повышает эффективность терапии, по сравнению со стандартной терапией, и позволяет сократить сроки клинического выздоровления [6, с. 337], [7, с. 264].
Цель исследования
Изучение эффективности лечения экспериментального псориаза эмульсией на основе трав: Trigonella foenum-graecum, Cyperus rotundus, Ammi visnaga, Acacia nilotica, широко применяемых в народной медицине стран Африки.
Материалы и методы исследования
Исследование проведено на 48 белых нелинейных мышах массой 16-20 г, находящихся в стандартных условиях содержания вивария. Животные получены из питомника «Столбовая», ФГБУ «Научный центр биомедицинских технологий» РАМН. Все эксперименты, уход и содержание осуществлялись в соответствии с Директивой № 63 от 22 сентября 2010 года Президиума и Парламента Европы «О защите животных, используемых для научных исследований», «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» от 06.04.1993 и Приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». Животные случайным образом были разделены на 8 групп по 6 особей обоего пола в каждой. Одинаковые по площади поверхности кожи на дорзальной части мышей обрабатывали депиляционным кремом, удаляли ватным тампоном, смоченным 0,9% раствором натрия хлорида. 1-я группа-контроль: на поверхность кожи, лишённой волосяного покрова, наносили крем имиквимод («Кераворт», Индия, Glenmarc pharmaceuticals LTD), содержащий 5% имиквимода (125 мг крем; 6,25 мг имиквимода), в течение 4 дней один раз в день. Доза имиквимода была подобрана эмпирически таким образом, чтобы вызвать наиболее оптимальные и воспроизводимые воспаления кожи у мышей, подобные при псориазе у человека. 2-я серия-контроль №2: кожа обрабатывалась керавортом и вазелином. 3-я серия-контроль №3: на кожу наносили кераворт и топические стероиды элоком (1 г мази содержит 1 мг мометазона фуроата, «Шеринг Плау», Швейцария). 4-я серия-контроль №4 – интактные животные без кераворта, обработка вазелином. 5-я серия – опытная: кожа была обработана керавортом и исследуемыми эмульсиями, содержащими сухие порошки трав, соотношение: трава Trigonella foenum-graecum и масло оливковое 1:2. В 6-й серии в состав исследуемой эмульсии входила Acacia nilotica, в 7-й - Ammi visnaga, в 8-й - Cyperus rotundus в таком же разведении.
Для оценки тяжести воспаления кожи спины использовали индекс PASI. Эритема, шелушение и утолщение оценивались кумулятивно по шкале в баллах от 0 до 4: 0 баллов - отсутствует признак; 1 балл - незначительный; 2 балла - умеренный; 3 балла - выраженный; 4 балла – максимально выраженный. Кумулятивный показатель (эритема + шелушение + утолщение) служил мерой тяжести воспаления (от 0-12 баллов), оценивался по каждой особи.
По окончании эксперимента из хвостовой вены забирали кровь, стабилизировали раствором цитрата натрия в разведении 1:10, исследовали на гематологическом анализаторе PCE-90Vet (США). По окончании эксперимента животных выводили из эксперимента эфиром для наркоза, извлекали и взвешивали селезёнку, забирали кусочек кожи из области поражения для гистологических исследований.
Результаты исследования обработаны статистически с использованием компьютерной программы Medstat. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05. По ходу изложения статистические показатели обозначены следующими символами: М – выборочное среднее, m (SEM) – ошибка среднего, р – достигнутый уровень значимости.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования
При оценке изменений имиквимод-обработанной кожи было выявлено развитие гиперемии, увеличение толщины эпидермиса и шелушение (рис. 1).
Рис. 1. Изменения кожных покровов белых мышей при экспериментальном псориазе:
1. Интактные мыши. 2. Контроль - обработка керавортом. 3. Эмульсия Trigonella foenum-graecum. 4. Обработка керавортом +эмульсия Cyperus rotundus.
5. Кераворт + эмульсия Acacia nilotica
Суммарный индекс PASI возрос с 0 баллов у интактных животных до 3,83±0,18 балла на фоне кераворта (рис. 2).
Рис. 2. Суммарный индекс PASI в баллах поражения кожи белых мышей при экспериментальном псориазе на фоне коррекции эмульсиями на основе порошков трав
Применение топических стероидов снижало данный показатель до 1,2 ±0,2 балла (р< 0,001). Обработка эмульсией с используемыми травами во всех случаях предупреждала развитие выраженных изменений кожи у экспериментальных животных, на что указывало снижение индекса PASI. Наиболее эффективными оказались эмульсии с Acacia nilotica и Cyperus rotundus: в данных сериях индекс PASI достиг минимальных значений 1,03±0,13 балла. Полученные данные свидетельствуют о высокой антипсориатической активности исследуемых трав, сопоставимой с топическими стероидами.
Аппликация кераворта на кожу экспериментальных животных приводит к снижению количества лейкоцитов в периферической крови с 7,36±1,78 до 3,8±0,51 (ри<0,002) (табл. 1).
Таблица 1
Показатели периферической крови белых мышей на фоне моделирования псориаза и лечения эмульсиями, содержащими лекарственные травы Trigonella foenum-graecum, Cyperus rotundus, Ammi visnaga, Acacia nilotica в разведении 1:2 (М ±м)
|
№ |
Серии опытов |
Лейкоциты, 109/л |
Лимфоциты, абс. число 109/л |
Моноциты, абс. число109/л |
Гранулоциты, абс. 109/л |
|
1 |
Интактные |
7,36±1,78 |
6,68±1,71 |
0,26±0,11 |
3,214±0,57 |
|
2 |
Контроль Кераворт |
3,8±0,51 ри<0,002 |
2,85±0,36 ри<0,001 |
0,125±0,05 ри<0,02 |
0,82±0,28 ри<0,002 |
|
3 |
Кераворт +элоком |
1,72±0,94 ри<0,001 рк<0,001 |
1,5±0,49 ри<0,001 рк<0,001 |
0 ри<0,001 рк<0,001 |
0,52±0,12 ри<0,03 рк<0,001 |
|
4 |
Кераворт +вазелин |
2,8±1,55 ри<0,001 рк>0,05 |
1,52±0,93 ри<0,001 рк<0,001 |
0,09±0,01 ри<0,001 рк>0,05 |
0,76±0,08 ри<0,002 рк>0,05 |
|
5 |
Кераворт+ Cyperus rotundus |
1,75±0,41 ри<0,002 рк<0,002 |
1,34±0,29 ри<0,002 рк<0,001 |
0,086±0,024 ри<0,002 рк>0,05 |
0,64±0,18 ри<0,002 рк>0,05 |
|
6 |
Кераворт + Ammi visnaga |
4,15±1,10 ри>0,05 рк<0,01 |
2,275±0,74 ри>0,05 рк<0,011 |
0,08±0,01 ри<0,002 рк>0,05 |
0,8±0,28 ри<0,002 рк>0,05 |
|
7 |
Кераворт + Acacia nilotica |
2,2±0,88 ри<0,002 рк<0,002 |
1,160,57 ри<0,002 рк<0,001 |
0,01±0,008 ри<0,002 рк<0,001 |
0,82±0,17 ри<0,001 рк>0,05 |
|
8 |
Кераворт+ Trigonella foenum-graecum |
2,2±0,88 ри<0,002 рк<0,002 |
2±0,5 ри<0,002 рк<0,001 |
0,08±0,04 ри<0,002 рк>0,05 |
1,74±0,40 ри<0,02 рк<0,01 |
Примечание: достоверность различия ри рассчитана по отношению к интактным, рк - животным опытной серии.
Развитие лейкопении можно расценить как системный эффект имиквимода, проявляющего иммунодепрессантное действие, основанное на изменении концентрации IL-23 /IL-17 [8, с. 300], что является нежелательным побочным эффектом.
Кроме того, развитие иммунного воспалительного процесса в коже повышает ее проницаемость для лекарственных веществ, способствуя развитию нежелательных системных эффектов иммунодепрессии [9, с. 1240]. Подтверждением системности действия кераворта при моделировании псориаза является и изменение в лейкоцитарной формуле периферической крови. Так, выявлено снижение абсолютного числа лимфоцитов с 6,68±1,71 у интактных животных до 2,85±0,36 х109/л (ри<0,001) на фоне кераворта. Аналогичная динамика выявлена и в моноцитарном пуле лейкоцитов. Значимо, почти в 4 раза уменьшилось количество нейтрофильных гранулоцитов – с 3,21±0,57 до 0,82±0,28х109/л (ри<0,002).
Применение топических стероидов (Элоком) корригирует местные проявления на коже у экспериментальных животных, однако усугубляет изменения в периферической крови. Так, нарастает лейкопения – общее число лейкоцитов снижается до 1,72±0,94, лимфоцитов – до 1,5±0,49 х109/л, гранулоцитов - до 0,52±0,12 х109/л. Усугубление цитопении на фоне применения топических стероидов является проявлением их иммунодепрессивного действия. Кераворт снижает количество эритроцитов в периферической крови белых мышей с 6,286±1,33 до 4,9±0,63х1012/л (табл. 2), что обусловлено проявлением иммунодепрессивного действия имиквимода.
Таблица 2
Показатели периферической крови белых мышей на фоне моделирования псориаза и лечения эмульсиями, содержащими лекарственные травы Trigonella foenum-graecum, Cyperus rotundus, Ammi visnaga, Acacia nilotica в разведении 1:2 (М ±м)
|
№ |
Серии опытов |
Эритроциты, 1012/л |
Гемоглобин, г/л |
Тромбоциты, 109/л |
|
1 |
Интактные |
6,286±1,33 |
143±7,74 |
1462,6±139,09 |
|
2 |
Контроль Кераворт |
4,9±0,63 ри<0,001 |
130±22,86 ри>0,05 |
587,25±44,3 ри<0,05 |
|
Кераворт +элоком |
4,8±0,63 ри<0,03 |
162,25±56,4 ри>0,05 |
2111±203,9 ри <0,001 рк<0,002 |
|
|
4 |
Кераворт +вазелин |
5,47±1,08 ри >0,05 |
127±37,3 ри >0,05 |
1883,75±249,60 ри <0,001 р к<0,002 |
|
5 |
Кераворт + Cyperus rotundus |
5,75±0,95 ри >,0,05 рк >0,05 |
114,2±10,96 ри <0,001 рк >0,05 |
772,4±85,3 ри <0,001 рк <0,002 |
|
6 |
Кераворт + Ammi visnaga |
6,49±0,69 ри >0,05 рк <0,01 |
116,5±3,41 ри <0,001 рк >0,05 |
1224,25±169,8 ри <0,001 рк <0,002 |
|
7 |
Кераворт + Acacia nilotica |
5,32±0,92 ри >0,05 рк >0,05 |
115±15,28 ри <0,001 рк >,0,05 |
712,2±81,47 ри <0,001 рк <0,002 |
|
8 |
Кераворт + Trigonella foenum-graecum |
5,80±0,64 ри >0,05 рк к>0,05 |
113,4±5,31 ри <0,001 рк <0,05 |
803,8±178,6 ри <0,001 рк <0,002 |
Примечание: достоверность различия ри рассчитана по отношению к интактным, рк - животным опытной серии.
Применение эмульсии с исследуемыми травами приводит к повышению количества эритроцитов, достоверное их увеличение установлено на фоне Ammi visnaga, показатели эритроцитов возросли до 6,49 ± 0,69 х1012/л (рк<0,01). Значения гемоглобина снизились на фоне аппликации эмульсий со всеми исследуемыми травами, хотя данная динамика не имеет критических рисков.
Показатели тромбоцитов уменьшились с 1462,6±139,09 х109/л у интактных животных до 587,25±44,3 (ри<0,05) в контроле на фоне кераворта. Топические стероиды приводят к росту тромбоцитов в периферической крови животных до 2111±203,9 х109л, что также обусловлено их стимулирующим влиянием на гемопоэз, однако может быть фактором риска тромбоза. Все исследуемые травы ограничивают рост тромбоцитов в сравнении с топическими стероидами, но предотвращают их снижение в сравнении с керавортом, то есть ограничивают его иммунодепрессивное действие.
Наиболее благоприятный эффект в модуляции количества тромбоцитов оказывает эмульсия, содержащая Ammi visnaga, на фоне применения которой число тромбоцитов наиболее приближено к показателям интактных животных и достигает уровня 1224,25±169,8 х109л (рк<0,001, рк <0,002).
С целью исследования влияния кераворта на состояние иммунокомпетентных органов исследована масса селезёнки у лабораторных животных (рис. 3).
Рис. 3. Масса селезёнки экспериментальных животных при псориазе
В контрольной серии (псориаз+кераворт) масса селезёнки не изменялась, однако в серии с элокомом произошло уменьшение массы органа с 0,188±0,04 до 0,125±0,04 г (ри <0,001), что свидетельствует о негативном эффекте топических стероидов - развитии системном иммунодепрессивного действия. Применение эмульсий с исследуемыми травами предотвращает угнетение лимфоидной ткани, о чём свидетельствует сохранение массы селезёнки на уровне интактных животных. Наибольшие значения массы селезёнки выявлены при использовании эмульсии, содержащей Cyperus rotundus, в данной серии масса селезёнки достигла 0,3±0,08 г (ри <0,001).
Обсуждение результатов
Позитивный фармакологический эффект применяемых при экспериментальном псориазе фитоэмульсий обусловлен химическими составляющими растений, влияющих на основные звенья патогенеза развития псориаза. Так, Акациевые виды содержат вторичные метаболиты, включая амины и алкалоиды, цианогенные гликозиды, циклолиты, жирные кислоты и масла семян, фторацетат, камеди, небелковые аминокислоты, терпены (включая эфирные масла, дитерпены, фитостерол и тритерпеновые гены и сапонины), гидролизуемые танины, флавоноиды и конденсированные танины [10, с. 145]. Наличие соединений, таких как танин (12-20%), терпеноиды, сапонины и гликозиды, флобетанин, галловая кислота, пирокатехин протокатехиновой кислоты, (+) - катехин, (-) эпигаллокатехин-5,7-дигаллат керамферо [10, с. 146], реализует антиоксидантную активность используемой эмульсии на основе Acacia nilotica. Фармакологические эффекты Trigonella foenum-graecum обусловлены в том числе и наличием N-метилникотиновой кислоты, впервые выделен из Trigonella foenum-graecum, превращающийся в никотиновую кислоту [10, c. 150]. Фитохимические исследования Cyperus rotundus выявили наличие алкалоидов, флавоноидов, дубильных веществ, крахмала, гликозидов и фурохромонов, а также многих новых сесквитерпеноидов [11, c. 1208]. Для этого растения отмечен ряд фармакологических и биологических мероприятий, в том числе антикандидозная, противовоспалительная, антидиабетическая, антидиарейная, цитопротекторная, антимутагенная, антимикробная, антибактериальная, антиоксидантная, цитотоксическая и апоптотическая, антипиретическая и анальгетическая активность.
Выводы
1. Эмульсии, содержащие в своём составе травы Trigonella foenum-graecum, Cyperus rotundus, Ammi visnaga, Acacia nilotica, проявляют антипсориатическую активность на модели экспериментального псориаза, индуцированного керавортом (5% имиквимод; 125 мг крем, 6,25 мг имиквимода), сопоставимую с эффектом топического стероида элоком. Максимальная клиническая эффективность выявлена у лекарственных форм, содержащих Cyperus rotundus и Acacia nilotica.
2. Кераворт оказывает негативное влияние на показатели периферической крови экспериментальных животных, вызывая развитие цитопении – снижения уровня общего количества лейкоцитов, моноцитов, лимфоцитов, нейтрофильных гранулоцитов, эритроцитов и тромбоцитов, что отражает системный иммунодепрессивный эффект имиквимода. Топический стероид элоком в комбинации с керавортом усугубляет изменения в показателях периферической крови, снижая значения лейкоцитов, гранулоцитов, лимфоцитов и моноцитов, вызывает атрофию селезёнки. Уровень тромбоцитов возрастает, что повышает риск тромбозов.
3. Наиболее эффективно корригируют изменения в периферической крови эмульсии с Ammi visnaga, предотвращая развитие лейкопении, эритропении и тромбоцитопении. Trigonella foenum-graecum корригирует снижение эритроцитов и тромбоцитов.