Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

THE BIOLOGICAL EFFECTS OF NANOPARTICLES OF SILICON DIOXIDE

Kosyan D.B. 1 Makaeva A.M. 1 Rusakova E.A. 1
1 Federal Research Centre of Biological Systems and Agro-technologies of the Russian Academy of Sciences
The increased interest of researchers to nanoobjects is caused by their unusual physical and chemical properties, features of biological action, which are often radically different from the properties of the same substance in the form of continuous phases or macroscopic dispersions. Recently, this applies to nanomaterials of nanostructured particles of silicon dioxide (NF SiO2) in the form of amorphous (silica) or crystalline (quartz) modification. Since there is no consensus on the toxic effects of this substance is appropriate to conduct research to assess its biological effects on the cell. In this paper, we used SiO2 LF, evaluated their physical and chemical characteristics. Genetically modified strains (lux-biosensors) with constitutive and inducible types of luminescence were used to assess the biological effect Of SiO2 NPS. Microbiological testing was additionally carried out to more accurately assess the potential bactericidal effects Of SiO2 NPS. Based on the evaluation of physical and chemical characteristics, it was found that SiO2 nanoparticles in aqueous suspension form three fractions with different size parameters. In particular, only 23% of SiO2 nanoparticles are dispersed in aqueous suspension to the size of 57 ± 8.5 nm, most (72%) form complexes having a diameter of 168 ± 38 nm. Assessment of the degree of activity of nanoparticles of SiO2 at different exposures (60, 120 min) contact with the cells of E. coli K12 TG1 with cloned luxCDABE genes P. leiongnathi 54D10 ("Ekolyum") showed that this substance in concentrations from 0.1 to 0,000195 M does not lead to the evolution of bacterial bioluminescence. Data for the evaluation of the kinetics of the luminescence of the strain Escherichia coli K12 MG1655 pkatG'::lux fully correlated with the data obtained when testing strain Escherichia coli K12 MG1655 psoxS'::lux, and do not demonstrate negative actions. The microbiological test confirms the results.
biological activity
nanomaterials
silicon dioxide
toxicity
lux-biosensors

Последние десятилетия создали предпосылки для управления рядом нанообъектов благодаря развитию многих отраслей науки и техники. Это стало возможным благодаря появлению частиц, которые обладают функционально значимыми свойствами и являются предметом изучения недавно появившейся области – нанотехнологии [1].

Наночастицы (НЧ) имеют размеры, сопоставимые с биомолекулами, поэтому могут быть созданы таким образом, чтобы позволит обеспечить наличие необходимых свойств. Например, используются наноматериалы с модифицированными поверхностями за счет прикрепления различных полимеров. Это позволяет увеличить совместимость вещества и биомолекулы и обеспечить селективную доставку [2; 3]. Сейчас известно о ряде таких нановеществ, которые тестируются либо приняты американским фармакологическим комитетом FDA (например, НЧ Fe2O3) [4].

В последнее время особое внимание приковано к наноструктурированным частицам диоксида кремния (НЧ SiO2) в виде кварца [5; 6] или кремнезема [7; 8]. Эти вещества рассматриваются как перспективный, биосовместимый и биодеградируемый материал, который способен проникать на клеточном и молекулярном уровнях и может использоваться для разработки лекарственных препаратов и диагностических средств [9]. Это возможно потому, что по форме частицы близки к сфере, а размер варьирует от 5 до 80 нм, что создает благоприятные условия для их модификации. Также при попадании в организм НЧ SiO2 быстро разрушаются в органах выведения до ортокремниевой кислоты и выводятся с мочой, что говорит об их возможной инертности [10]. Однако постоянно появляются новые данные об имеющемся токсическом действии НЧ SiO2. Последние исследования показывают, что при определенных концентрациях возможен негативный эффект на клетки человека, например, при дозе выше 190 мкг/мл наблюдается токсическое действие на культуру клеток человека, а при введении НЧ SiO2 мышам внутрь брюшины в дозе 50 мкг/кг отмечена активация перитонеальных макрофагов [11]. Таким образом, требуются дополнительные исследования биологического действия данных наночастиц.

Цель исследования: оценить биологический эффект наночастиц диоксида кремния.

Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования в лабораториях микробиологии и молекулярной генетики Испытательного центра ФГБНУ «Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий РАН».

Работа включала комплексную физико-химическую и биологическую оценку наночастиц диоксида кремния в условиях in vitro.

В качестве исследуемых нанопрепаратов выступали наночастицы диоксида кремния (НЧ SiO2) («Передовые порошковые технологии», Томск).

Исследование физико-химических характеристик наночастиц включало оценку дзета-потенциала с использованием анализатора наночастиц Photocor Compact («Фотокор», Россия), а также размеров, формируемых в водной среде агрегатов наночастиц с помощью метода динамического светорассеивания.

Для визуализации наночастиц использовали атомно-силовой микроскоп Certus Light (Nanoscan technology, Россия) экипированный кантилеверами NSG 10 с жесткостью балки 37,6 N/m и радиусом зонда <10 нм (Tips Nano, Estonia). Сканирование проводили в воздушной среде в режиме прерывистого контакта.

Предварительно наночастицы диоксида кремния подвергались ультразвуковому воздействию на диспергаторе (f-35 кГц, N-300 Вт, А-10 мкА) в течение 30 минут. Размер наночастиц определяли с использованием электронного микроскопа JSM-740 IF.

Для дальнейших исследований приготовлялась серия последовательных разведений от 4 М до 0,1*10-9 М.

Биологическая оценка действия НЧ SiO2 проводилась с использованием генно-модифицируемых штаммов (lux-биосенсоры) с конститутивным и индуцибельным типами свечения.

В варианте конститутивного характера свечения был использован штамм E. coli K12 TG1 pF1, содержащий плазмиду pF1 с кассетой luxCDABE-генов Vibrio fischeri МГУ-6, производство НВО «Иммунотех» (Россия, Москва) в лиофилизированном состоянии под коммерческим названием «Эколюм». Для проведения биотестирования лиофилизированный препарат «Эколюм» был регидратирован с помощью дистиллированной воды в объеме 5 мл, охлажденной до 8 °С, после чего выдержан при 2-4 °С в течение 30 мин. Перед проведением исследований бактериальная суспензия стандартизовалась до ОП450=0,45 ед. Затем в лунки планшета смешивали НЧ SiO2 (100 мкл) и суспензию люминесцирующих бактерий (100 мкл) в соотношении 1:1.

В варианте индуцибельного характера бактериального свечения были использованы штамм Escherichia coli K12 MG1655 pkatG'::lux (для детекции перекиси водорода), а также Escherichia coli K12 MG1655 psoxS'::lux (для детекции супероксид-аниона).

Используемые для этого lux-биосенсоры культивировали при 37 °С на LB-агаре с 100 мкг/мл ампициллина, после чего дополнительно подращивали в LB-бульоне до достижения ранней log-фазы и суспендировали в 0,5%-ном растворе NaCl до достижения ОП450=0,05 ед. Полученные суспензии в объеме по 50 мкл вносили в лунки планшета, содержащие по 50 мкл предварительно подготовленных разведений НЧ (см. выше), выдерживали 15 мин для формирования повреждающего эффекта, после чего дополнительно вносили по 100 мкл LB-бульона, содержащего трофические субстраты для энергетического обеспечения биолюминесценции.

Для доказательства работоспособности индуцибельных штаммов использовались специфические химические воздействия, вызывающие индукцию стрессовых генов: штамм E. coli K12 MG1655 pkatG'::lux и psoxS'::lux – подвергали воздействию перекиси водорода и метилвиологена (параквата). Расчет индекса индукции (ИИ) биолюминесценции проводили по формуле, аналогичной расчету ИТ.

Проведение теста ингибирования бактериальной люминесценции осуществлялось в измерительном блоке микропланшетного анализатора Infinite PROF200 (TECAN, Австрия).

Регистрация интенсивности свечения полученных смесей осуществлялась в течение 180 мин с интервалом 5 мин. Результаты влияния НЧ диоксида кремния на интенсивность бактериальной биолюминесценции оценивали с использованием следующей формулы:

,

где Ik и Io – это показатели интенсивности свечения контрольных и опытных проб на 0-й и n-й минутах измерения.

Определялись 3 пограничных уровня токсического действия:

1. 0-20 - образец не токсичен.

2. 20-49 - образец слабо токсичен.

3. 50-100 - образец токсичен.

На основании полученных данных рассчитывали величины токсикологического параметра ЕС50, соответствующие концентрациям НЧ диоксида кремния, вызывающим 50%-ное подавление свечения lux-биосенсоров по сравнению с контролем.

Микробиологическое тестирование проводилось дополнительно для более точной оценки потенциального бактерицидного действия НЧ SiO2. Для этого была использована суточная культура нелюминесцирующего штамма E. coli K12 TG1. Штамм выращивался на твердой питательной среде (LB-агар) при 37 °С в течение 18-24 часов. Далее была приготовлена суспензия микроорганизмов в деионизированной воде с оптической плотностью ОП450=0,5 ед. После этого бактериальная суспензия смешивалась с водными суспензиями НЧ (1:1), из которых приготовлялась серия 10-кратных разведений в объеме 50 мкл и высевались на поверхность LB-агара.

Контролем выступала проба, содержащая клетки бактерий, смешанные в аналогичных пропорциях с деионизированной водой. Далее пробы культивировались в течение 24-48 ч при 37 °С. Затем проводили подсчет колоний и на основании полученных результатов оценивали наличие и выраженность (%) бактерицидного эффекта НЧ SiO2.

Все эксперименты были проведены в 3 повторностях. Полученные результаты обрабатывались с использованием компьютерной программы Statistica 10.0, а также пакета программ Microsoft Excel. Для расчета применялся критерий энтропии Шеннона. Достоверность оценивалась при вероятности ошибки p≤0,05, высокозначимыми считали различия при p≤0,01 и p≤0,001.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты аттестации препарата наночастиц выявили различные физико-химические характеристики. Порошок нанопрепаратов диоксида кремния содержал 99,8% SiO2 и порядка 0,2% Cl2; форма соответствовала сфере. Согласно паспорту препаратов размер частиц составлял 40,9±10 нм. Удельная поверхность составляла для SiO2(I) 109 м2/г.

Поскольку заявленные физико-химические параметры нанопрепарата несколько отличаются от реальных, было проведено дополнительное тестирование заявленных веществ с целью объективной оценки их функциональной активности.

По данным динамического рассеяния света наночастицы SiO2 в водной суспензии образуют три фракции с различными показателями параметра размеров (табл. 1).

Таблица 1

Основные физические параметры наночастиц SiO2

Препарат

Фракция, %

Диаметр, нм

Дзета-потенциал, мВ

SiO2

23

57 ± 8.5

-25.13 ± 0.33

72

168 ± 38

15

> 1500

 

В частности, выявлено, что из наночастиц SiO2 только 23% частиц диспергируются в водной суспензии до размеров 57 ± 8,5 нм, большая часть (72%) образует комплексы, имеющие диаметр 168 ± 38 нм. Около 15% формируют крупные конгломераты диаметром >1500 нм. В свою очередь, дзета-потенциал нанопрепарата диоксида кремния характеризовался отрицательным значением, не превышающим 25 мВ.

Оценка степени активности наночастиц SiO2 при разных экспозициях (60, 120 мин) контакта с клетками E.coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами P.leiongnathi 54D10 («Эколюм») показал, что данное вещество в концентрациях от 0,1 до 0,000195 М не приводило к изменению динамики бактериальной биолюминесценции. Увеличение концентрации до 4 М отмечалось проявлением биологической активности наночастиц SiO2 (I), выражающейся в 30%-ном ингибировании свечения клеток, тем не менее можно характеризовать данные дозировки как слабо токсичные или не токсичные (рис. 1).

Рис. 1. Динамика свечения E.coli K12 TG1 с клонированными lux CDABE-генами P.leiongnathi 54D10 при контакте с наночастицами SiO2 в различных концентрациях

Анализ параметра «доза-эффект» также не выявил явного токсического действия исследуемого нанопрепарата (табл. 2)

Таблица 2

Степень сохранности клеток E. coli на 120-й минуте теста биолюминесценции

Время, мин

Концентрация, М

0,00004

0,0001

0,0002

0,0005

0,001

0,003

0,006

0,0125

0,025

0,05

0,1

120

1

0,93±0,13

0,89±0,32

0,86±0,18

0,84±0,23

0,84±0,5

0,87±0,27

0,88±0,44

0,85±0,03

0,83±0,11

0,80±0,08

0,79±0,14

 

Согласно данным вышеуказанной таблицы можно определить весь диапазон концентраций биологически инертным в рамках летального исхода клетки. Все значения находились в пределах значения контроля, а расхождения были незначительными. Оценка данных lux-биосенсоров не позволили зафиксировать развивающееся во времени дозозависимое подавление свечения, поскольку токсический эффект не достигал уровня ЕС50.

Таким образом, на этапе оценки потенциального негативного действия исследуемого вещества не было зарегистрировано острой токсичности.

Однако для наночастиц характерно выраженное окислительное действие, поэтому на втором этапе проведения биолюминесцентного тестирования нами были проведены серии экспериментов для оценки потенциального воздействия свободных форм кислорода на бактериальные клетки. Для этого оценивался токсический эффект и возможность окислителя инициировать индукцию промотора окислительного стресса.

Оценка кинетики свечения Escherichia coli K12 MG1655 psoxS'::lux при воздействии наночастиц диоксида кремния в различных концентрациях не выявила явно выраженного окислительного действия. Весь ряд разведений находится в диапазоне фонового свечения контрольного образца. При этом пик свечения принадлежит именно этому образцу. Все исследуемые концентрации подобного уровня не достигали, отличаясь на 20-25% в среднем в сторону уменьшения. Незначительные отличия касаются более низких концентраций.

Данные по оценке кинетики свечения штамма Escherichia coli K12 MG1655 pkatG'::lux полностью коррелируют с данными, полученными при тестировании штамма Escherichia coli K12 MG1655 psoxS'::lux (рис. 2 а, б).

Рис. 2: а) кинетика свечения штамма Escherichia coli K12 MG1655 psoxS'::lux при воздействии НЧ SiO2; б) кинетика свечения штамма Escherichia coli K12 MG1655 pkatS'::lux при воздействии НЧ SiO2

Результаты, полученные с использованием lux-биосенсоров с индуцибельным характером бактериального свечения, подтвердили полученные ранее эффекты и позволили констатировать отсутствие характера окислительного действия. Не было выявлено, что индукция свечения обусловлена действием супероксид-аниона, который образовался в результате контакта наночастиц с бактериальной клеткой и способствовал гибели тест-организма при высоких концентрациях анализируемого вещества.

Описанные выше эффекты стали основой для последующей оценки жизнеспособности (табл. 3) в клетках E.coli, подвергнутых стрессовому воздействию после предварительной инкубации в контакте с НЧ SiO2.

Таблица 3

Влияние НЧ SiO2 на сохранение жизнеспособности клеток E.coli

Концентрация НЧ SiO2, М

Остаточное количество КОЕ (в % к контролю)

0,1

93,37±2,5*

0,05

93,34±1,8

0,025

95,93±0,9*

0,0125

95,45±1,3

0,006

96,02±1,1

0,003

96,89±2,1

0,001

97,31±0,9

0,0005

97,74±4,3**

0,0002

97,87±7,6*

0,0001

98,31±1,1

0,00005

97,01±1,7

Контроль

100

Примечание: * – p <0,05; ** – p <0,01.

Заключение

Проведенные исследования демонстрируют низкую токсичность данной наночастицы. Показано, что взаимодействие НЧ SiO2 с клетками бактерий не вызывает негативного действия, что подтверждено рядом тестов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования (Грант президента MK-3631.2017.11).