Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

COMPARATIVE STUDIES OF COMPLEX PREPARATIONS АRGININE WITH HEPARIN AND PLANT HEPARINOID

Lyapina M.G. 1 Uspenskaya M.S. 1 Lyapina L.A. 1
1 Moscow State University named after M.V. Lomonosov
Methods have been developed for the preparation of complex drugs including arginine and heparin of animal origin (preparation 1), as well as arginine and heparinoid from the roots of Paeonialactiflora (preparation 2) with a molar ratio of components of 3: 1. Comparative studies of the haemostasiological properties of drugs under conditions in vitro and in vivo. Both drugs showed anticoagulant and fibrin-de-polymerization properties, but in preparation 2 compared to preparation 1, a predominant effect on the inhibition of fibrin polymerization was observed. The mechanism of fibrin depolymerization action of drugs 1 and 2 is deciphered, which consists in inhibiting the final stage of the clotting process - the formation of a fibrin clot. Preparations 1 and 2 in the future can be used as antithrombotic agents that do not cause hemorrhagic effects on the body. The most effective drug is a complex drug 2.
anticoagulant
blood
arginin
heparin
heparinoid from paeonia roots
mechanism of action

Ранее было установлено, что аминокислота аргинин улучшает реологические свойства крови, препятствует тромбообразованию [8,11] и оказывает положительные эффекты на метаболизм жиров и углеводов [1,6]. Ингибирующие свертывание крови эффекты аргинина обусловлены тем, что он является предшественником оксида азота (NO) [5], который вырабатывается эндотелиальными клетками сосудов. Оксид азота участвует в функционировании ряда систем организма, в том числе и гемостаза [9]. Один из природных антикоагулянтов системы гемостаза – гепарин животного происхождения, а также другие гликозаминогликаны блокируют свертывающую активность тромбина [4] и других протеиназ [13] при одновременном проявлении в организме противовоспалительного действия. Таким же действием обладает и гепариноид, полученный из корней пиона молочноцветкового [3]. Показано, что в гепариноиде из пиона содержится часть нефракционированного гепарина (НФГ) по антифакторной IIa (анти-IIa) активности и присутствует низкомолекулярный гепарин (НМГ) по антифакторной Ха (анти-ХА) активности. Соотношение этих активностей антиIIа/антиXa в среднем было 1 : 2,03. Молекулярная масса гепариноида составляла 5,7 kDa [2]. Экспериментальные данные, подтвержденные затем в клинических условиях, свидетельствуют об активации противосвертывающей активности гепарином, гепариноидом и НМГ при ишемическом инсульте [10, 12].

Цель исследования – создание противосвертывающих комплексных препаратов аргинина с гепарином и гепариноидом из корней пиона молочноцветкового и сравнительное изучение их влияния на полимеризацию фибрина, антикоагулянтную и антитромбоцитарную активность крови крыс в условиях invitro и invivo при пероральном введении животным.

Материал и методы исследования

В работе использовали стандартный нефракционированный гепарин (НФГ) фирмы Serva (Германия); гепариноид, полученный из корней пиона молочноцветкового, выращенного в Ботаническом саду МГУ имени Ломоносова [3], содержащий НФГ и низкомолекулярный гепарин (НМГ); аргинин фирмы Reanal (Венгрия).

Разработаны способы получения комплексных препаратов аргинин – гепарин (препарат 1) и аргинин – гепариноид из пиона (препарат 2). Методом перекрестного электрофореза доказано при комплексообразовании существование взаимодействия между гуанидогруппами аргинина и кислыми группами гепарина или гепариноида. В условиях invitro проводили определение суммарной и неферментативной фибринолитической (фибриндеполимеризационной) активности; антикоагулянтной активности и агрегации тромбоцитов при добавлении к плазме крови здоровых животных (0,1 мл) комплексных препаратов 1 и 2 в объеме 0,025 мл в пределах концентраций от 10-5 до 10-1  мг/мл.

В экспериментах in vitro и in vivo использовали более 60 лабораторных белых крыс–самцов с массой тела 200–220 г. Все исследования на животных проведены в соответствии с этическими принципами и документами, рекомендованными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург; 15.06.2006). В опытах in vivo животные были разделены на 5 групп: крысам первой опытной группы вводили комплексный препарат аргинина с гепарином (препарат 1) в дозе 0,1 мг/кг массы тела, животным второй опытной группы – комплексный препарат аргинина с гепариноидом из пиона (препарат 2) в дозе 0,1 мг/кг,  крысам третьей контрольной группы – гепарин в дозе, эквивалентной его содержанию в комплексе 1, четвертой контрольной группы – гепариноид в дозе, эквивалентной его содержанию в комплексе 2, пятой контрольной группы – аргинин в дозе, эквивалентной содержанию его в комплексах, животным шестой контрольной  группы вводили тот же объем, т.е. по 0,3 мл, 0,85 %-го раствора NaCl (растворитель). Введение растворов препаратов производили перорально. Взятие крови осуществляли через 2 ч после введения из venajugularis с использованием в качестве консерванта 3,8 %-ного лимоннокислого натрия в соотношении 9:1, которую затем центрифугировали в двух режимах – при 1000g в течение 5 мин (получали богатую тромбоцитами плазму для определения агрегации тромбоцитов) и затем при 2000g в течение 10–12 мин для получения бестромбоцитарной плазмы. Производили определение следующих параметров свертывающей и противосвертывающей систем плазмы крови: суммарную (СФА) и неферментативную (НФ) фибринолитическую активность, активность тканевого активатора плазминогена (ААП). На приборе анализатор свертывания крови АСКа-2-01 АСТРА (Россия) определяли активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ). Агрегацию тромбоцитов (АТ) измеряли на агрегометре (Россия) с использованием в качестве агреганта раствора аденозиндифосфата (АДФ) в концентрации 2 мкМ [2].

Все данные были обработаны статистически по непараметрическому критерию Вилкоксона (программа STATISTICA 6).

Результаты исследования и их обсуждение

Нами установлено, что в чистой системе (условия in vitro) комплексные препараты 1 и 2проявляли СФА за счет НФ (или фибриндеполимеризационной активности – ФДПА) в широком интервале концентраций от 10-7до 10-1 мг/мл, в то время как составные части – гепарин, растительный гепариноид и аргинин в концентрациях, эквивалентных их содержанию в комплексах, не обнаруживали фибринолитического действия или же оказывали слабый эффект (зоны лизиса составляли до 4 мм2). Следовательно, оба комплексных препарата препятствовали процессу полимеризации фибрина, причем препарат 2 – в большей степени. При этом в комплексных препаратах установлено наличие антикоагулянтной активности (по тесту АЧТВ) при их концентрации в плазменной среде от 10-5 до 10-1 мг/мл; из составных частей только гепарин и в большей степени гепариноид в эквивалентных дозах проявляли антикоагулянтную активность, но более слабую по сравнению с комплексными препаратами. АТ плазмы в присутствии комплексов в чистой системе в концентрации 10-2 –10 -3  мг/мл снижалась на 18 % (препарат 1) – 21 % (препарат 2) по сравнению с контрольными пробами после добавления  физиологического раствора. Следовательно, в условиях in vitro комплексы отличаются от составных частей значительным эффектом по антикоагулянтной активности (тест АЧТВ) и фибриндеполимеризационной активности (ФДПА). Большую антикоагулянтную и ФДПА проявлял комплексный препарат 2 (с растительным гепариноидом) по сравнению с комплексным препаратом 1 (с гепарином животного происхождения). В табл. 1 представлены данные, полученные при действии препаратов 1 и 2 при их концентрациях в системе 10-1 мг/мл в условиях in vitro.

Таблица 1

Влияние комплексных препаратов аргинин-гепарин (1) и аргинин-гепариноид из пиона (2) в концентрациях 10-1 мг/мл на антикоагулянтную активность плазмы и процессы фибринообразования в условиях in vitro (M ± m)

Препараты

АЧТВ, с

(в присутствии плазмы крови)

СФА, мм2

ФДПА, мм2

      в отсутствие плазмы крови

Опытная группа 1 – комплекс

аргинин-гепарин

69,0 ± 0,7**

47,0 ± 1,2**

46,8 ± 0,7**

Опытная группа 2 – комплекс аргинин-гепариноид

65,6 ± 0,7**

48,8 ± 1,8**

48,6 ± 0,7**

Контрольная группа 3

гепарин

40,9 ± 1,6*

3,5 ± 0,3*

3,4 ± 0,5**

Контрольная группа 4

гепариноид

40,0 ± 1,8*

4,4 ± 0,3*

4,4 ± 0,9**

Контрольная группа 5

аргинин

36,7 ± 1,7

0,9 ± 0,1

0,0 ± 0,0

Контрольная группа 6 – физиологический раствор

 

36,2 ± 2,2

0,3 ± 0,1

0,3 ± 0,0

Примечание. Достоверность различий рассчитана относительно соответствующих проб контроля.  **p< 0,01, *p< 0,05.  Обозначения: АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время, собственная СФА – суммарная фибринолитическая активность, ФДПА – фибриндеполимеризационная активность.

 

Через 2 ч послеперорального введения комплексных препаратов 1 и 2 в дозе 0,1мг/кг выявлен повышенный фон антикоагулянтной активности по тесту АЧТВ, превышающий антикоагулянтную активность плазмы после введения физиологического раствора в 2,2 и 2,8 раза соответственно. При этом введение препаратов 1 и 2 приводило к увеличению СФА в 1,44 и в 1,9 раза соответственно, НФ – в 3,4 и в 4,6 раз соответственно, ААП – почти в 2.0 раза по сравнению с 6 контрольной группой, получавшей 0.85 %-ный раствор NaCl. Введение крысам эквивалентной по отношению к комплексу дозы аргинина (5 контрольная группа) не приводило к изменению СФА, НФ, ААП. Пероральное введение эквивалентной по отношению к комплексу  дозы гепарина (3 контрольная группа) практически не изменяло исследуемых параметров гемостаза за исключением СФА плазмы, которая имела лишь тенденцию к увеличению по сравнению с контрольной группой 6 (введение физиологического раствора). Введение гепариноида из пиона оказывало более значительный эффект по АЧТВ, которое удлинялось 1,4 раза, СФА и НФ, которые увеличивались в 1,2 и в 2,7 раза соответственно по сравнению с 6 контрольной группой. Итак, гепариноид из пиона в этих условиях проявлял также антикоагулянтную активность, но в более слабой степени, чем комплексный препарат 2. Гепарин в эквивалентной дозе при пероральном приеме обнаруживал незначительный антикоагулянтные свойства в плазме крови крыс. После введения эквивалентной дозы аргинина не было отмечено резкого изменения антикоагулянтной активности плазмы крови. Агрегация тромбоцитов под действием перорального введения всех исследуемых препаратов практически не менялась, за исключением  препарата 2, который имел тенденцию к снижению агрегации тромбоцитов (табл. 2).

Таблица 2

Суммарная фибринолитическая активность (СФА), неферментативный фибринолиз (НФ), активность тканевого активатора плазминогена (ААП), агрегация тромбоцитов, антикоагулянтная активность (по тесту АЧТВ) в плазме крови крыс через 2 ч после перорального введения комплексных препаратов аргинина с гепарином или гепариноидом в дозе 0,1 мг/кг и их составных частей в эквивалентных количествах (M±m)

Вводимые препараты

АЧТВ, с

Агрегация тромбоци-тов, %

 

СФА, мм2

НФ, мм2

ААП, мм2

Опытная группа  1 –  препарат1

73,0 ± 1,3**

105,0 ± 6,9

56,9 ±1,2**

36,1 ±1,2**

20,1 ± 1,6**

Опытная группа 2 –препарат 2

91,1 ± 0,9**

90,0 ± 3,3*

64,5 ± 1,1**

46,5 ±  1,0**

19,9 ± 2,0**

Контрольная группа 3 –гепарин

38,0 ± 2,5*

115,5±1,1

39,7 ± 3,4*

19,6 ±4,8

13,1±1,2

Контрольная группа 4 –гепариноид

45,9 ± 1,5**

 

94,3 ± 1,4*

 

45,0 ± 0,7**

 

29,3 ± 0,9*

 

14,3 ± 1,0 *

 

Контрольная группа 5 –аргинин

34,0 ± 1,0

 

101,4 ± 0,9

36,2 ± 0,7**

 

10,8 ± 0,5*

 

13,5 ± 1,5

 

Контрольная группа 6 – 0.85 % NaCl

32,1 ± 1,1

 

100,1 ± 2,4

 

32,6 ± 1,3

 

10,5 ± 1,8

 

10,3 ± 1,4

 

Примечание. Достоверность различий рассчитана относительно соответствующих проб контроля. ** p< 0,01, * p<0,05. Обозначения: АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время, СФА – суммарная фибринолитическая активность, НФ – неферментативная фибринолитическая активность, ААП – активность тканевого активатора плазминогена.

Cледовательно, при сравнении противосвертывающих активностей после перорального введения комплексов аргинин-гепарин и аргинин-гепариноид из пиона установлены значительные эффекты каждого из комплексных препаратов по сравнению с составными частями в отношении СФА в плазме крови, ее НФ, активности тканевого активатора плазминогена плазмы крови, АЧТВ. Препарат 2, включающий аргинин с гепариноидом из пиона, оказывал более значительный эффект по проявлению в кровотоке антикоагулянтной, суммарной и неферментативной фибринолитической активностей. Это, возможно, обусловлено тем, что гепарин при пероральном применении неактивен, но оказывает противосвертывающий эффект лишь в комплексе с аминокислотами, белками, пептидами [3,7]. В гепариноиде из пиона присутствует помимо НМГ и НФГ и пептид [3], поэтому и гепариноид из пиона, и комплекс с ним проявляют значительные антикоагулянтно-фибринолитические эффекты и имеют тенденцию к снижению агрегации тромбоцитов.

Заключение

В настоящей работе показано, что при сравнении противосвертывающих эффектов комплексных препаратов 1 (аргинин-гепарин) и 2 (аргинин-гепариноид из пиона) и их составных частей – гепарина, гепариноида и аргинина в эквивалентных дозах в условиях invivo наибольший противосвертывающий эффект обнаруживает комплексный препарат 2, что указывает на более длительное его сохранение в кровотоке. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу применения именно комплексных препаратов, а не отдельных их частей, в случае возникновения предтромботических состояний в организме. Комплексные препараты проявляют в организме сочетанное антикоагулянтное, ферментатиное фибринолитическое и фибриндеполимеризационное действие, благодаря чему они относятся к антикоагулянтно-фибринолитическим средствам. Препарат 2 в отличие от препарата 1, оказывает, хотя и незначительное, антитромбоцитарное действие, что может служить экспериментальным обоснованием совместного применения гепариноида из пиона и аргинина в низких дозах для эффективного предупреждения тромботических осложнений при развитии гиперкоагуляции в организме.