Интенсивная восстанавливающая косметика последнего поколения профессионального уровня, прежде всего, содержит биологически активные ингредиенты с анти-оксидантными свойствами, благотворно влияющие на состояние кожных покровов и стимуляцию процессов клеточного метаболизма. Оптимальный баланс витаминов, макро- и микроэлементов крайне важен для обеспечения биохимических и физиологических процессов, протекающих в коже.
Микроэлемент селен один из девятнадцати наиболее важных микроэлементов, обеспечивающих не только здоровье, но и нормальное функционирование органов и систем организма. Белки, содержащие селен, относятся к группе «селенопротеинов». Селен обеспечивает работу и активность глутатионпероксидазы – основного фермента, участвующего в детоксикации организма и играющего ключевую роль в защите организма от ооксидативного стресса. Кроме того, селен-содержащие ферменты обеспечивают рецеркуляцию аскорбиновой кислоты, восстановителя и кофермента метаболических процессов, в активную форму. Селено-содержащие ферменты из группы дейодиназы обеспечивают превращение не активного гормона Т4 в более активный Т3[1].
В активном центре фермента-антиоксиданта глутатионпероксидазы находится остаток аминокислоты селеноцистеина. Глутатионпероксидаза, защищая от окисления белки, липиды и восстанавливая липидные перекиси, предотвращает нарушение клеточных мембран, не допускает их деформацию, нарушения в структуре ДНК, тем самым помогает сдерживать процесс старения кожи и восстанавливать ее структуру, разглаживать мелкие морщины, оказывает противовоспалительное действие при дерматологических заболеваниях. Дефицит селена может проявляться в виде сухой, шершавой кожи, медленно заживающих кожных ран, подверженности кожи инфекции, появления на ней высыпаний, трещинок, гематом. Потребность кожи в селене увеличивается под воздействием ультрафиолетового излучения, электрических разрядов, радиации.
В последнее время широкое распространение получили космецевтические средства в состав которых включен селен. Эта косметика, во-первых, улучшает клеточную функцию кожи, ускоряя процессы ее регенерации, во-вторых, повышает выработку коллагена, и соответственно улучшает эластичность кожи, в-третьих, минимизирует фотоповреждения от солнца.
Можно выделить три поколения препаратов, содержащих селен.
Первое поколение этих препаратов основано на селенате и селените натрия, сернистом селене. Препараты этого поколения обладают невысокой биодоступностью, имеют побочные действия.
Препараты второго поколения основаны на соединениях селена с биолигандами (селен-цистеин, селен-метионин или двухвалентные формы селена). Они более безопасны, биодоступны и имеют большую эффективность.
В препаратах третьего поколения используется наносредство, представляющее собой наномолекулярную селенопротеиновую матрицу, содержащую селен. Основное преимущество препаратов третьего поколения заключается в их более низкой токсичности, причем стабилизированные белком наночастицы селена с размерами 20–60 нм обладают высокими проникающими свойствами, лучше накапливаются в тканях, сохраняя при этом весь спектр биологической активности ионного селена, восполняя его необходимый запас и активируя синтез селенсодержащих ферментов [2, 3]. Наноразмерность частиц селена позволяет использовать их в составе антивозрастных космецевтических средств, поскольку обеспечено не только глубокое проникновение активного вещества в глубинные слои кожи, но и адресная доставка биологически активных ингредиентов.
Актуальность использования наноселена в космецевтике обуславливается возможностью длительного применения таких препаратов с минимальным риском развития побочных эффектов.
В качестве полимера, стабилизирующего селенопротеиновую матрицу при применении наноселена для кожных покровов, часто выбирают хитозан [4]. Хитозан проникает в кожу не только трансдермально, но и трансфолликулярно, трансгландулярно. Известно, что он эффективно связывает ионы водорода, различных металлов (в том числе токсичных и радиоактивных) и органических водорастворимых веществ, имеет отличный сорбирующий эффект, хитозан стимулирует регенерационные процессы кожи.
Несмотря на существующие дискуссии относительно эффективности использования липолсом, с целью транспортировки биологически активных веществ в глубокие слои кожи, липосомы по-прежнему используются в качестве транспортного средства биологически активных веществ, не разрушающихся на поверхности эпидермиса, так они биологически совместимы с клетками кожи и липосомная частица просто встраивается в липидные бислои мембран [5].
Цель исследования: разработка и исследование липосомального крем-бальзама с наноселеном.
Материалы и методы исследования
На разных этапах работы объектами исследований являлись: субстанция наноселена на подложке из бычьего сывороточного альбумина, стабилизированного хитозаном, липосомальные основы различных составов и способов получения, разработанное космецевтическое средство.
В ходеразработки и исследования крем-бальзама применялись технологические, биофармацевтические и фармакологические методы исследований.
Результаты исследования и их обсуждения
Учитывая все положительные стороны воздействия наноселена на кожу, в качестве активного антиоксиданта для введения в липосомальную композицию применялся наномолекулярный селенопротеин.
В результате многостадийно факторного анализа была выбрана матрица-носитель для наноселена – бычий сывороточный альбумин, стабилизированный хитозаном.
Так как наноселен с хитозановым комплексом для космецевтических средств применялся впервые, сначала исследовали его токсичность in vitro на модели Parameciumcaudatum. Было установлено отсутствие токсичности субстанции наноселена в концентрациях менее 0.00014 мг/мл.
Следующим этапом наших исследований был выбор способа получения липолсом. Исследовались три широко используемых способа: приготовление липосом: методом обращения фаз, инжекционным методом, методом ручного встряхивания. По результатам проведенных технологических исследований установлено, что диаметр везикул липосом с наноселеном, сформированных методом встряхивания, оптимально подходит для разрабатываемого крема бальзама [6]. Мультиламеллярная структура полученной композиции способствует глубокому проникновению активных ингредиентов и может применяться для любого типа кожи. Основа, в которую вводились липосомы, представляла собой гель, способный стабилизировать липосомы, и имела следующий состав: вода, глицерин, масло оливковое, лецитин, витамин Е, эпофен, веторон, диквертин, циклометикон, натрия хлорид, нейтрализованный карбомер, шаромикс, катон, парфюмерная композиция.
Кроме того, установлено, что хитозан, используемый для стабилизации наноселена, является дополнительным источником стабилизации и самих липосом, увеличивая срок хранения липосомальной композиции.
Первичные скрининговые исследования полученной липосомальной композиции наноселена, проведенные в опытах in vitro на парамециях, продемонстрировали высокую биологическую активность и мембранотропное действие. Проведенные исследования дали основания предполагать, что липосомальный крем с наноразмерными частицами селена должен существенно выступать как активатор клеточного метаболизма и улучшать барьерно-защитную функцию кожных покровов.
Следующим этапом для разработанной рецептуры было проведение более детальных испытаний в опытах in vivo, в частности изучение ранозаживляющего действия и противовоспалительной активности.
Эксперименты in vivo проводились на крысах-самцах линии Wistar весом 200–250 г, полученных из вивария Пятигорского медико-фармацевтического института филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ.
Животные содержались по шесть особей в клетке, при естественном освещении, с обычным рационом питания и свободным доступом к воде.
Изучение ранозаживляющего действия разработанного средства проводилось на модели линейной кожной раны (размер 1 см) [7, 8].
Перед экспериментом крысы были разделены на 4 группы по 6 животных в каждой.
Первая группа (контрольная) – животные, не получавшие лечения после нанесения раны.
Вторая группа (опытная) – животные, которым на рану ежедневно наносили разработанный липосомальный крем-бальзам.
Третья группа (опытная) – животные, которым ежедневно на повязку наносили раствор наноселена.
Поскольку липосомальных кремов с наноселеном нет, то в качестве препарата сравнения был выбран мультиламеллярный крем Anna Lotan с липосомами / Lipo Soft Cream (серия Classic) производство Израиля с регенерирующим эпидермальным эффектом.
Четвертая группа (препарат сравнения) – животные, которым на рану ежедневно наносили крем Anna Lotan.
Визуальное наблюдение за линейной раной и динамикой раневого процесса продемонстрировало:
- в первые сутки после нанесения линейной раны у крыс всех экспериментальных групп выявлена интенсивная местная воспалительная реакция в виде гиперемии и отечности тканей, граничащих с раневой поверхностью;
- на третьи сутки эксперимента у всех животных на поверхности линейной раны начал формироваться образовался струп;
- у животных контрольной группы и группы, получающий раствор наноселена, наблюдалось фрагментарное отторжение струпа. У животных оставшихся групп наблюдалось плотное прилегание струпа к поверхности линейной раны.
Появление молодой соединительной ткани в виде грануляций являлось признаком заживления раны. Показатели ранозаживляющего действия приведены в таблице 1.
При применении экспериментального крем-бальзама с наноселеном на 10 день наблюдения все раны зажили без рубцов. Средняя скорость заживления раны составила 2,4±0,2 мм/сутки. В группе животных, которым накладывалась повязка, смоченная раствором наноселена, раны заживили на 11 день, рубцов нет, однако в течение первой половины наблюдений размер раны уменьшался плохо, раневая поверхность мокла, затем процесс эпитализации пошел быстрее. В группе сравнения раны уменьшались равномерно, зажили на 11 день, рубцов нет. Средняя скорость заживления раны составила 2,25±0,3мм/сутки. В контрольной группе раны зажили на 12 день, раневая поверхность гноилась, имеются рубцы. Средняя скорость заживления раны составила 2,0±0,2 мм/сутки.
Таблица1
Показатели ранозаживляющего действия
Препарат |
Средний линейный размер раны (мм) |
|||||
6 день |
7 день |
8 день |
9 день |
10 день |
11 день |
|
Контроль (физ. р-р) |
6,00± 0,012* |
4,67± 0,016* |
3,33± 0,023* |
2,33± 0,134* |
0,67± 0,216* |
0,33± 0,021* |
Опытный образец (крем-бальзам с наноселеном) |
4,33± 0,075* |
2,67± 0,040* |
1,67± 0,040* |
1,00± 0,024* |
0 |
0 |
Опытный образец (повязка, смоченная наноселеном) |
6,00± 0,012* |
4,50± 0,016* |
2,75± 0,045* |
1,41± 0,037* |
0,43± 0,034* |
0 |
Препарат сравнения (Anna Lotan крем с липосомами ) |
5,00± 0,024* |
3,00± 0,029* |
2,33± 0,012* |
1,00± 0,034* |
0,33± 0,006* |
0 |
Примечание: * – изменения достоверны относительно контроля, p<0,05;
M – среднее арифметическое;
m – стандартная ошибка среднего арифметического.
Результаты исследования, приведенные в таблицы 1, свидетельствуют, что наиболее выраженным ранозаживляющим эффектом обладает экспериментальный липосомальный крем-бальзам с наноселеном, достоверно уменьшая сроки заживления линейной раны.
Влияние экспериментального крема с наноселеном на течение воспалительного процесса (интенсивность экссудативной фазы и качество процесса пролиферации) изучали на 24 крысах-самцах линии Wistar массой 200–250 г. Пролиферативное воспаление индуцировалось имплантацией простерилизованного ватного шарика массой 15 мг. У животных под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг) в асептических условиях после разреза всех слоев кожи формировали полость, в которую вкладывали ватный шарик, затем края раны сшивали [6, 7].
На 8 сутки опыта имплантированный шарик с образовавшейся вокруг него грануляционной тканью извлекался из полости, взвешивался и высушивался до постоянного веса при температуре 60 ºС в течение нескольких дней. О величине экссудативной фазы воспаления судили по разнице в весе шарика до и после высушивания, о величине пролиферативной фазы – по разнице в весе высушенного и исходного шарика.
Контрольным животным повязка пропитывалась физиологическим раствором. В первой опытной группе исследуемый липосомальный крем-бальзам с наноселеном на хитозановой основе наносили тонким слоем на стерильную марлевую повязку. На протяжении восьми дней повязка менялась один раз в сутки. Второй опытной группе повязка пропитывалась раствором наноселена. Группе сравнения наносили тонким слоем на стерильную марлевую салфетку крем Anna Lotan.
Результаты опыта, обработанные методами вариационной статистики, представлены в таблице 2.
Таблица 2
Показатели противовоспалительной активности липосомального крем-бальзама с наноселеном на модели пролиферативного воспаления
Группы животных |
Количество животных |
Экссудация, мг |
Пролиферация, мг |
Контроль (физ. раствор) |
6 |
128,75±0,37 * |
17,58±0,16 * |
Опытный группа (крем-бальзам с наноселеном) |
6 |
109,51±0,53 * |
13,11±0,17 * |
Опытный группа (повязка, смоченная наноселеном) |
6 |
114,21±0,42 * |
15,55±0,20 * |
Группа сравнения (крем Anna Lotan с липосомами ) |
6 |
123,11±0,91 * |
16,75±0,10 * |
Примечание: * – изменения достоверны относительно контроля, p<0,05;
M – среднее арифметическое;
m – стандартная ошибка среднего арифметического.
Как показали исследования, разработанный крем-бальзам с наноселеном достоверно снижает величину отёка относительно контроля на 14,9,0 %, раствор наноселена – на 8,3 %, препарат сравнения Anna Lotan с липосомами – на 4,3 %.
Применение липосомального крем-бальзама с наноселеном на хитозановой основе выявило достоверное снижение синтеза грануляций на 25,4 %, применение раствора наноселена – на 11,5 %, препарата сравнения – на 4,7 %.
На модели пролиферативного воспаления установлено, что разработанный крем- бальзам имеет выраженное противовоспалительное действие.
Выводы. По результатам проведенных исследований установлено, что разработанное космецевтическое средство, крем-бальзама с наноселеном на хитозановой основе обладает ранозаживляющим и противовоспалительным эффектом. Добавление наноселена на хитозановой основе в липосомальную основу позволяет рассматривать полученную композицию как активатор клеточного метаболизма, интенсифицирующий процессы обновления клеток, тканевой регенерации, эпитализации ран. Противовоспалительные и ранозаживляющие свойства наноселена в липосомальной композиции впервые использованы в практике отечественной космецевтики.
Созданный крем-бальзам может быть рекомендован как для нормальной, так и для склонной к раздражению и поврежденной кожи. Входящие в состав липосомальной основы фосфолипиды поддерживают водно-жировой баланс кожи; наноселен на хитозановой основе не только предохраняет кожу от вредного воздействия внешних факторов, но и стимулирует естественный процесс восстановления клеток, тем самым предотвращая преждевременное старение кожи, восстанавливая ее структуру, что придает кожным покровам бархатистость и упругость, устраняет раздражение и шелушение, Разработанные рецептуры можно использовать как в промышленных условиях, так и в условиях малого бизнеса.