Известно, что фенотипические и генотипические признаки одного вида микроорганизмов, выделенных от различных людей в разных регионах, могут отличаться [1-4; 15].
Способность к адгезии кишечных лактобацилл изучают, используя клетки линий Caco-2 и HT29-MTX. G.J. Chauviere с соавторами [6] обнаружил, что не все штаммы лактобацилл адгезировались на энтероцитоподобных клетках Caco-2, указывая на штаммоспецифичность. Выявлено, что L.acidophilus BG2FO4 и LB, L. rhamnosus DR20, L. acidophilus HN017, L. casei Shirota, L. rhamnosus LC-705 прикрепляются к энтероцитоподобным клеткам Caco-2 [10].
Адгезия лактобацилл происходит за счет пассивных сил, электростатического и гидрофобного взаимодействия, а также специфических структур [7]. L. johnsonii La1 проявляет высокую кальцийнезависимую адгезивность по отношению к культуре клеток Caco-2. Выделен поверхностный протеин L. fermentum 104R с молекулярной массой 29 kDa, который может вызывать адгезию, участвуя в прикреплении этого штамма к слизистой оболочке тонкого кишечника [12]. Установлено, что липотейхоевая кислота отвечает за адгезию L. johnsonii La1. L. fermentum имеет поверхностные лектиноподобные структуры белковой природы, благодаря которым штамм проявляет свои адгезивные свойства [8].
Установлено, что многие штаммы L. casei и L. plantarum имеют выраженный добавочный слой - гликокаликс, который можно рассматривать в качестве их адгезина. В то же время штаммы L. fermentum и L. acidophilus гликокаликса не имеют, или же он слабо выражен, и адгезия последних связана с другими структурами клеточной оболочки лактобацилл [8].
Таким образом, лактобациллы содержат большое количество разнообразных внешних структур, отвечающих за взаимодействие с эпителиальными клетками кишечника.
Недавние исследования показали, что несколько штаммов, идентифицированных с помощью API® 50 CHL как L. plantarum, оказались микроорганизмами вида L. pentosus, что было выявлено молекулярно-генетическими методами. В API® 50 CHL также отсутствуют профили базы данных видов L. gasseri, L. jensenii, L. iners и L. vaginalis, что может привести к неверной идентификации [9; 14]. В то же время установлено, что результаты идентификации видов L. plantarum, L. fermentum, L. acidophilus, L. delbrueckii, L. casei, L. rhamnosus, полученные с использованием полимеразной цепной реакции, соответствуют результатам классического биохимического метода идентификации на основе сахаролитической активности различных видов лактобацилл [5].
Бактерии рода Lactobacillus обладают бродильным типом метаболизма, обладают способностью сбраживать лактозу при помощи р-галактозидазы. Образующиеся в ходе расщепления лактозы глюкоза и галактоза вступают на путь катаболизма гексоз по фруктозо-1,6-бисфосфатному пути (гликолиз) или по пентозофосфатному пути. Особенности катаболизма гексоз определяют подразделение представителей рода на две биохимические группы: гомо- и гетероферментативные лактобациллы (которые наряду с молочной кислотой образуют значительное количество газа и ароматические вещества) [11]. Примеры гомоферментативных молочнокислых бактерий: L. casei, L. acidophilis. Примеры гомоферментативных молочнокислых бактерий: L. fermentum, L. brevis.
Получены данные, что 22% L. plantarum, выделенных из молочных продуктов Украины, не синтезировали биогенных аминов, и большинство штаммов лактобацилл не выделяло ацетон [13].
Цель работы: в сравнительном аспекте определить биохимическую активность, адгезивные и антагонистические свойства лактобацилл, выделенных от коренных жителей ЦФО РФ и Западного Казахстана.
Методика
Материалом для исследования послужили фекалии, выделенные от здоровых людей в возрасте 19-21 года, постоянно проживающих в Центральном федеральном округе РФ и Западном Казахстане. Лактобациллы выделяли из фекалий путем посева на среду МРС «HI Media» (Индия) и культивирования при 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 3-5%. Идентификация проводилась по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам с использованием API®50 CHL «Bio Mérieux Vitek, Inc.».
Первичное исследование антагонизма лактобацилл к тестовым культурам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов проводили согласно методике прямого антагонизма; после биохимической идентификации антагонистическую способность микроорганизмов выявляли методом отсроченного антагонизма по Л.П. Блинковой (2003). В качестве тест-культур были использованы следующие штаммы: Candida albicans АТСС 885-653, Salmonella enterica Typhimurium 415, Shigella sonnei I фазы 941 из коллекции культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН; Bacillus subtilis 534 из коллекции МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского; Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича. В качестве контроля использовался штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3 из коллекции МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского с известным спектром антагонистической активности.
Адгезивную активность лактобацилл определяли, пользуясь средним показателем адгезии (СПА) по методу В.И. Брилис (1986) на эритроцитах человека О (I) группы Rh+.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате выделено 27 штаммов лактобацилл от здоровых коренных жителей Казахстана и 22 штамма – от жителей ЦФО РФ.
При определении биохимических свойств лактобацилл выявлено, что 6 штаммов, выделенных от жителей ЦФО РФ, принадлежат к виду L. fermentum. Данный вид не выделялся из кишечника здоровых коренных жителей Казахстана. Метил-βD-глюкопиранозид ферментировали L. fermentum только в 33%.
К виду L. plantarum было отнесено 13 штаммов, выделенных от жителей Казахстана, и 15 - от жителей ЦФО РФ. D-тагатозу (15%), L-фукозу (8%), крахмал (8%), гликоген (8%), глицерол (15%) и D-арабит (46%) ферментировали только L. plantarum, выделенные у жителей Казахстана. Штаммы L. plantarum, выделенные от жителей ЦФО, ферментировали метил-βD-глюкопиранозид и L-сорбозу в 100% случаев. D-арабинозу ферментировали только штаммы (25%), выделенные от жителей ЦФО (рис. 1).
Вид L. rhamnosus был идентифицирован у 10 штаммов, выделенных от жителей Казахстана, и у 9 - от жителей ЦФО РФ. Глицерол (30%) и D-ликсозу (10%) ферментировали L. rhamnosus, выделенные только у жителей Казахстана. D-раффинозу ферментировали 25% штаммов, выделенных только от жителей ЦФО (рис. 2).
К виду L. paracasei отнесены 3 штамма, выделенные от жителей Казахстана, 2 - от жителей ЦФО РФ. В 67% случаев штаммы L. paracasei, выделенные только у жителей Казахстана, ферментировали инозитол.
Рис. 1. Биохимическая активность L. plantarum, выделенных от жителей ЦФО РФ и Казахстана
Адгезия на культуре клеток. Значения среднего показателя адгезии (СПА) лактобацилл, выделенных от жителей Западного Казахстана – 0,95, что соответствует отсутствию адгезивных свойств. Лактобациллы у жителей ЦФО РФ (2,48) обладали среднеадгезивными свойствами.
Антагонистическая бактериальная активность лактобацилл, выделенных от жителей Казахстана, уступает таковой у жителей ЦФО РФ примерно в 2 и более раза в отношении грампозитивных и грамнегативных микроорганизмов, а противогрибковая активность совершенно отсутствует по отношению к дрожжевым грибам рода Candida (таблица).
Ферментативная активность штаммов лактобацилл, выделенных от жителей Западного Казахстана, адаптирована к традиционной мясной пище. В большей степени выявлены ферменты, утилизирующие нутриенты животного происхождения, и в меньшей – растительного. Так, отмечена активность в отношении инозитола, раффинозы, гликогена, туранозы, метил-βD-глюкопиранозида.
Рис. 2. Биохимическая активность L. rhamnosus, выделенных от жителей ЦФО РФ и Казахстана
Лактобациллы жителей ЦФО более активны в отношении растительных компонентов: метил-βD-глюкопиранозида, D-раффинозы, D-арабинозы.
Антагонистическая активность лактобацилл
|
№ п/п |
Тест культуры микроорганизмов |
Антагонистическая активность лактобацилл жителей Казахстана в мм (M±m) |
Антагонистическая активность лактобацилл жителей ЦФО РФ в мм (M±m) |
|
1. |
Candida albicans АТСС 885-653 |
0±0 |
8,6±4,5 |
|
2. |
Salmonella enterica Typhimurium 415 |
11,0±2,0 |
27,7,0±1,6 |
|
3. |
Shigella sonnei I фазы 941 |
13,2±2,1 |
18,2±6,2 |
|
4. |
Escherichia coli АТСС 25922 |
11,5±2,3 |
27,2±0,8 |
|
5. |
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 |
14,1±1,9 |
27,6±0,7 |
|
6. |
Staphylococcus aureus АТСС 25923 |
14,3±2,3 |
28,1±1,5 |
|
7. |
Bacillus subtilis 534 |
16,3±2,5 |
25,2±0,6 |
Лактобациллы жителей Казахстана обладали низкой и средней антагонистической активностью в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов и не действовали на дрожжевые грибы рода Candida, адгезивные свойства практически отсутствовали. Лактобациллы, выделенные от жителей ЦФО РФ, выгодно отличались своим высоким антагонизмом к грамположительным и грамотрицательным бактериям и грибам рода Candida. Адгезивные свойства соответствовали средним показателям.
Вывод. Лактобациллы, выделенные от жителей Западного Казахстана и ЦФО РФ, отличаются друг от друга ферментативной активностью, способностью к адгезии и активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам. У лактобацилл жителей ЦФО РФ более выражена протективная и персистирующая активность по сравнению с лактобациллами жителей Казахстана. Лактобациллы коренных жителей Западного Казахстана показали более выраженную ферментативную активность в расщеплении животных компонентов пищи, в то время как лактобациллы жителей ЦФО РФ были более активны в отношении растительных. Этот факт нужно учитывать при создании новых эффективных пробиотиков на основе лактобацилл.