Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

С позиции патологии клеточных и субклеточных процессов многие заболевания имеют общие патогенетические звенья даже в тех случаях, когда их клинические проявления, связанные с поражением различных органов и тканей, не однотипны. В связи с тем что практически любая патология реализуется на клеточном уровне, а универсальным для всех клеток является их мембранное построение, становится понятным, что нарушения в структуре цитоплазматических и внутриклеточных биомембран являются общими патогенетическими элементами любого болезненного процесса [2].

В настоящее время уделяется большое внимание изучению структурно-метаболического и функционального статусов эритроцитов, являющихся своего рода «клеточным дозиметром» действия факультативных и облигатных экзо- и эндогенных факторов, становящихся причиной различных заболеваний. При этом большинство авторов исходят из позиции, что красные кровяные клетки, помимо осуществления присущей им специфической газотранспортной функции, принимают участие в обеспечении стабильности и регуляции кислотно-основного состояния и водно-солевого обмена, определяют микрореологические свойства крови и функции иммунокомпетентных клеток и т.д., участвуя тем самым в процессах, связанных с поддержанием гомеостаза на уровне целого организма [5; 16].

Частота острых и хронических заболеваний печени в общей структуре болезней человека и смертность от этого вида патологии неуклонно растет даже в экономически развитых странах. Вопросы патогенеза, диагностики и лечения острых и хронических заболеваний печени остаются одними из актуальных в медицине как ввиду сложности диагностики и выбора оптимальных эффективных методов лечения, так и вследствие тенденции к росту количества больных этими заболеваниями [8].

В литературе имеется большое количество работ, посвященных коррекции нарушений функций печени, в том числе с использованием клеточных технологий [9; 10], есть единичные исследования по эритроцитарным нарушениям и их коррекции при патологии печени [1], и фактически отсутствуют работы по корригирующему влиянию на метаболическую активность эритроцитов трансплантации ксено- и аллогенных клеток и их культуральных гуморальных факторов.

Исходя из вышеизложенного целью работы стало установление возможностей коррекции метаболического статуса эритроцитов периферической крови использованием ксено-, аллогенных гепатоцитов, фетальных фибробластов, их культуральных жидкостей при экспериментальном остром токсическом поражении печени (ОТПП).

Материал и методы. Исследования проведены на 92 крысах-самцах породы Вистар массой 100-160 г. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 10-12 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал ±10%. Все исследования проводили в одно и то же время суток, с 8 до 12 часов, с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986), и согласно правилам лабораторной практики РФ (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003). Животных выводили из опыта на шестые сутки декапитацией под эфирным наркозом после первого введения четыреххлористого углерода (ЧХУ) ксено-, аллогенных гепатоцитов (КГ, АГ), фибробластов (ФБ) или их культуральной жидкости.

ОТПП у лабораторных животных моделировали путем внутримышечного введения ЧХУ в дозе 3 мл/кг в виде 50%-ного раствора в оливковом масле пятикратно с интервалом 24 ч [12].

Выделение ксеногенных (мышиных) и аллогенных гепатоцитов от новорожденных животных производилось по методике M.N. Berry, D.S. Friend [17]. ФБ выделяли из фрагментов туловища и конечностей тканей 8-12-недельного абортуса человека путем их механической дезинтеграции до микрофрагментов размером 0,1-0,2 мм и дальнейшего выращивания клеток. Жизнеспособность клеток определяли в тесте исключения красителя – трипанового синего, при этом клеточные суспензии, содержащие менее 90% жизнеспособных клеток, не использовали. После отмывания и концентрации путем центрифугирования суспензию клеток в концентрации 2 х 106 /кг вводили внутрибрюшинно, пятикратно, через 24 часа, с первой инъекцией гепатотропного яда крысам с ОТПП, в объеме 0,5 мл в среде 199 [3; 15].

С целью получения культуральной жидкости мышиных и аллогенных гепатоцитов (КЖМГ, КЖАГ) в среде 199 культивировали 5х107 клеток на 3 мл среды, содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки, в течение 6 ч. После истечения срока инкубации клетки осаждали центрифугированием (15 мин при 400 g). Концентрацию белка в культуральной жидкости определяли с использованием красителя Кумаси G-250 по Брефорд. Полученные КЖМГ и КЖАГ вводили с первой инъекцией гепатотропного яда пятикратного (с 24-часовым интервалом) внутрибрюшинно крысам с ОТПП из расчета 5 мг/кг белка [5; 15].

В качестве источника продуцируемых ФБ гуморальных факторов использовали кондиционированную человеческими фетальными фибробластами полную культуральную среду (альфа-МЕМ (AppliChem, Германия) с 10% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, США), которую забирали после 3-суточного культивирования в ней клеток, начиная с концентрации 15 х 104/мл и до формирования ими монослоя на дне флакона (на 2-е сутки). Полученную культуральную жидкость ФБ (КЖФБ) вводили внутрибрюшинно в объеме 35 мг/кг ксеногенным реципиентам с ОТПП, одновременно с первой инъекцией ЧХУ.

Группа контроля включала 15 здоровых крыс того же возраста, пола и массы тела.

Для оценки функционального состояния гепатоцитов в плазме крови определяли активность аспартат- и аланинаминотрансфераз (АСТ, АЛТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), гаммаглутаминтранспептидазы (ГГТ), содержание билирубина, протромбиновый индекс (ПТИ) и тимоловую пробу. Концентрацию фибриногена исследовали методом Рутберг. Величины всех перечисленных показателей определяли унифицированными методами с использованием стандартных наборов реактивов.

Подсчет общего количества эритроцитов и содержания гемоглобина проводили по общепринятым методикам. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах оценивали по содержанию ацилгидроперекисей (АГП) и малонового диальдегида (МДА) [13]. Кроме этого, определяли внутриэритроцитарную активность супероксиддисмутазы (СОД) [6], сорбционную способность эритроцитов (ССЭ) [14] и сорбционную емкость их гликокаликса (СЕГ) [11].

Статистическую обработку результатов исследования проводили по общепринятым критериям вариационно-статистического анализа с вычислением средних величин (M), ошибки средней арифметической (m) с помощью пакета компьютерных программ Microsoft Excel, 2010. Существенность различий оценивали по U-критерию. Статистически значимыми считали различия с p=0,05 [7]. Степень расстройств лабораторных показателей рассчитывали по формуле [4]:

Примечание: в интервале от 1 до 33% полученная величина соответствует первой степени лабораторных расстройств, от 34 до 66% - второй, более 66% - третьей.

Результаты исследования и их обсуждение. У животных с 5-кратным отравлением ЧХУ выявлено развитие основных биохимических синдромов поражения печени: цитолиза (увеличение активности в сыворотке крови АСТ и АЛТ), внутрипеченочного и внепеченочного холестаза (повышение активности ЩФ и ГГТ), внутриклеточного холестаза с желтухой и токсическим поражением гепатоцитов (увеличение содержания билирубина и активности исследованных ферментов), недостаточности синтетических процессов (снижение ПТИ и содержания фибриногена) и воспалительного (повышение тимоловой пробы).

При оценке показателей метаболизма эритроцитов установлено, что введение гепатотоксического яда снижает их общее количество, содержание гемоглобина, активность СОД сорбционные показатели, повышает МДА и АГП (табл. 1).

Таблица 1

Влияние ксено-, аллогенных гепатоцитов и фибробластов на метаболическую активность эритроцитов периферической крови при остром токсическом поражении печени (M±m)

Примечание. Здесь и далее: звездочкой отмечены достоверные отличия средних арифметических (p = 0,05); цифры рядом со звездочкой – по отношению к показателям какой группы даны эти различия.

Введение КГ крысам с ОТПП нормализует общее количество эритроцитов, не влияет на сниженное содержание гемоглобина и корригирует остальные исследованные лабораторные параметры метаболизма эритроцитов в сторону показателей здоровых интактных животных, но не до значений нормы. Применение ФБ, в отличие от предыдущей группы, не влияло на повышенный отравлением ЧХУ уровень АГП и сниженную активность СОД. Введение АГ реципиентам с ОТПП нормализует общее количество эритроцитов, концентрацию МДА, не влияет на сниженное содержание гемоглобина и корригирует в сторону показателей интактных крыс уровень АГП, активность СОД и сорбционные показатели мембраны эритроцитов (табл. 1).

Применение КЖМГ или КЖФБ нормализует общее количество эритроцитов, содержание в них гемоглобина, сорбционную способность эритроцитов (СЕЭ) и корригирует в сторону значений нормальных показателей концентрацию АГП, активность СОД и сорбционную емкость гликокаликса эритроцитов (СЕГ). Введение экспериментальным животным с ОТПП КЖАГ корригирует СЭГ, активность СОД и нормализует остальные исследованные показатели метаболизма эритроцитов (табл. 2).

При количественном сопоставлении числа нарушенных показателей в различных условиях опыта установлено, что после отравления ЧХУ из 7 исследованных лабораторных показателей метаболизма эритроцитов оказались нарушенными 100%. Введение КГ или ФБ нормализовало по 14,3% и соответственно корригировало 71,4% и 42,9% метаболических эритроцитарных параметров. АГ нормализовали 28,6% и корригировали 57,1% показателей. Более эффективным оказалось введение надосадочной жидкости клеток; так, применение КЖКГ и КЖФБ нормализует и корригирует соответственно 57,1% и 42,9% параметров, а КЖАГ 85,7 и 14,3 показателя (табл. 3).

Таблица 2

Влияние культуральной жидкости ксено-, аллогенных гепатоцитов и фибробластов на метаболическую активность эритроцитов периферической крови при  остром токсическом поражении печени (M±m)

Таблица 3

Сравнительное влияние ксено-, аллогенных гепатоцитов, фибробластов и их культуральной жидкости на метаболические показатели эритроцитов в условиях острого токсического поражения печени (M±m)

При сопоставлении показателей с делением глубины нарушений по степеням установлено, что при отравлении ЧХУ нарушенными III, II и I степени оказались соответственно 28,6-42,8% и 28,6% исследованных параметров. Введение КГ или ФБ реципиентам с ОТПП снижает количество нарушенных показателей с III и II степенью соответственно до 14,3% и 28,6%, что требует обязательной фармакологической коррекции [4]. Число аналогичных нарушений при применении АГ составило по 14,3%. Введение НЖМГ или НЖФБ в течение периода интоксикации снижает число нарушенных лабораторных показателей III, II и I степени до трех (по 14,3%). Наиболее эффективным оказалось введение НЖАГ, т.к. измененным, и только I степени, оказался один исследованный показатель (14,3%) метаболизма эритроцитов (табл. 4).

Таблица 4

Лабораторные показатели метаболизма эритроцитов в условиях острого токсического поражения печени по степени расстройств при введении ксено-, аллогенных гепатоцитов, фибробластов и их культуральной жидкости

По данным литературы и по настоящей работе известно, что воздействие ЧХУ приводит к сдвигу баланса про- и антиоксидантов в сторону ослабления последних, то есть к усилению ПОЛ клеточных мембран, что в конечном итоге дестабилизирует мембраны не только гепатоцитов, но и клеток крови, и в первую очередь – эритроцитов, причем изменения структурно-функциональных свойств эритроцитов направлены на уменьшение прочности и эластичности мембраны, снижение ее деформируемости, метаболической активности, текучести, сорбционной способности и изменение поляризуемости [1; 5; 12].

Основной путь прогрессирования хронических и острых заболеваний печени вне зависимости от этиологического фактора, приводящего к ее повреждению – это процесс фиброгенеза, развитию которого предшествует мембранодеструкция клеток-мишеней (гепатоцитов) и клеток крови, развивающаяся в результате интенсификации процессов липопероксидации и накопления высокоцитотоксичных продуктов ПОЛ. Гиперактивация процессов пероксидации липидов сопровождается значительным изменением состава и степени окисленности мембранных фосфолипидов, что в конечном итоге приводит к нарушению целостности липидного бислоя клеточных мембран и снижению активности фосфолипидзависимых энзиматических систем. В условиях активного протекания свободнорадикальных процессов наиболее резко уменьшается количество фосфолипидов, содержащих в своем составе полиненасыщенные жирные кислоты. Избирательная делипидизация мембран вызывает увеличение соотношения между содержанием холестерина и фосфолипидов в бислое, что способствует нарушению физико-химических свойств цитомембран [2; 16].

Гуморальные факторы культуральной жидкости гепатоцитов интактных крыс аллогенным реципиентам в условиях острого гипоксического поражения печени наиболее эффективны по сравнению с таковыми в культуральной жидкости ксеногенных гепатоцитов, или введения самих клеток, корригируют нарушения функциональной активности гепатоцитов, возникающие вследствие кратковременной ишемии органа [15].

В условиях наших опытов установлены аналогичные приоритеты в отношении КГ, ФБ, АГ, их культуральных жидкостей в условиях модели ОТПП по отношению к метаболическим нарушениям в эритроцитах. Не исключено, что действующими агентами являются гуморальные факторы, которые продуцируются in vivo при введении ксено- или аллотрансплантированных клеток или непосредственно попадают реципиентам с ОТПП с соответствующей культуральной жидкостью.

Заключение

Таким образом, для наиболее эффективной коррекции метаболических нарушений эритроцитов периферической крови в условиях острого токсического поражения печени возможно применение гуморальных факторов культуральной жидкости аллогенных гепатоцитов.