Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

POLYMORPHISM OF PROINFLAMMATORY CYTOKINES IL-1B, IL-6, TNFA GENES IN PATIENTS WITH ULCERATIVE COLITIS IN RUSSIAN POPULATION OF CHELYABINSK REGION

Stashkevich D.S. 1 Burmistrova A.L. 1 Kobelyatskaya A.A. 1
1 Chelyabinsk State University
The comparative analysis of frequency distribution alleles, genotypes and genotype combinations of genes key pro-inflammatory cytokines IL-1b, IL-6, TNFA was conducted in patients with ulcerative colitis (UC) and healthy subjects Russian population of the Chelyabinsk region. A reduction of + 3953 *T IL-1β rare allele frequency in patients with ulcerative colitis was found out. The dominant pattern of inheritance of the wild-type allele + 3953 *C IL-1β in a homozygous form was more common in patients with ulcerative colitis, and can probably influence to the predisposition to this disease. The marker combination of genotypes for ulcerative colitis: IL-1β + 3953CC- IL-6 -174 GG, TNFA -308 GG - IL-6 -174 CC were shown. A reduction in carrier combination of genotypes of IL-1β +3953 TC - IL-6 -174 CC in patients with ulcerative colitis was found out.
genetic polymorphism
proinflammatory cytokines
ulcerative colitis

Несмотря на то, что неспецифический язвенный колит (НЯК) известен более 150 лет, на данный момент нет точной информации относительно его этиологии и патогенеза. Считают, что возможно в основе патологии лежит процесс дискриминации иммунного гомеостаза в толстой кишке – микробиота /эпителиально-иммунно-нервная единица. Значительным звеном в развитии НЯК считают наследственную предрасположенность. Согласно литературным данным, у пациентов с неспецифическим язвенным колитом нарушается баланс между про- и противовоспалительными цитокинами. Дисрегуляция иммунных реакций вызывает чрезмерный синтез и активацию провоспалительных цитокинов, что отражается в повышении концентрации провоспалительных цитокинов, таких как IL-1b, TNFa в слизистой кишечника [7, 8].

Кроме того, по данным Hanaola T. и Yoshimura A., в биоптатах слизистой оболочки толстой кишки у больных НЯК установлено повышение уровня IL-6, коррелирующее со степенью активности воспаления и содержанием острофазовых белков. Согласно данным последних лет, различия в генах, контролирующих защитные реакции организма, могут влиять на уровень продукции кодируемых белков и, тем самым, на характер протекания иммунного ответа. В связи с этим функциональный полиморфизм генов цитокинов представляет значительный интерес, т. к. именно эти белки вносят наибольший вклад в регуляцию иммунитета [2].

При отсутствии главного причинного гена, исследование наследственных основ сводится к установлению комплекса генов, обуславливающих подверженность к сложнонаследуемому заболеванию, в частности к неспецифическому язвенному колиту. Составной частью подобного рода молекулярно-генетических исследований является анализ ассоциаций заболевания с полиморфными вариантами генов-кандидатов, белковые продукты которых, предположительно, могут быть вовлечены в патогенез заболевания.

Цель: сравнительный анализ распределения частот встречаемости аллельных вариантов, генотипов и комбинаций генотипов полиморфизмов генов IL-1β+3953C/T, IL-6-174G/C, TNF-α-308G/A у больных неспецифическим язвенным колитом и здоровых лиц русской популяции Челябинской области.

Задачи:

  1. Установить частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфизмов генов IL-1β+3953C/T, IL-6-174G/C, TNFА -308G/A у больных неспецифическим язвенным колитом в сравнении с практически-здоровыми лицами русской популяции Челябинской области.
  2. Оценить вклад взаимодействий межгенных комбинаций генотипов генов IL-1β, IL-6, TNFА в предрасположенность/устойчивость к НЯК.

Материалы и методы

Проведенная работа относится к типу ретроспективных исследований «случай–контроль».

Контингент обследуемых лиц. Выборка больных НЯК состояла из 127 человек русской этнической группы с диагнозом НЯК, которые находились на лечении в гастроэнтерологических отделениях Дорожной клинической больницы МПС на станции Челябинск и ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница».

В качестве контрольной группы (234 человек) использовали популяционную выборку, сформированную случайным образом на основе ДНК-банка потенциальных доноров стволовой клетки ГБУЗ «Челябинская областная станция переливания крови», проживающих в г. Челябинске и Челябинской области. Популяционная принадлежность определялась по данным генеалогического анамнеза до третьего поколения (согласно рекомендациям 8-го Международного Симпозиума в 1980 г., Лос-Анджелес, США).

Таблица 1

Демографическая характеристика обследуемых групп

 

Контрольная группа

Больные НЯК

234

%

127

%

Мужчин

47

55,3

56

44,1

Женщин

38

44,7

71

55,9

Средний возраст, лет

34,6±0,75

41,9±1,3

 

Методы исследования

Эксперимент состоял из следующих этапов:

  1. Пробоподготовка – выделение ДНК из цельной крови;
  2. ПЦР-амплификация;
  3. Детекция – электрофорез и гель-документирование.

В качестве биологического материала для исследования использовалась венозная кровь, взятая в пробирки с 0,5 % раствором калиевой соли этилендиаминтетра уксусной кислоты (ЭДТА). Выделение ДНК проводили с использованием реагентов PROTRANS DNA Box 500. Определение SNPs в полиморфных сайтах +3953C/T, -174G/C и -308G/A генов IL-1β, IL-6, TNFА  проводилось аллель-специфической ПЦР с реактивами ООО НПФ «Литех» г. Москва с последующей УФ-детекцией результатов в 3% агарозном геле.

Характеристика исследуемых генов

Ген IL-1β содержит 22 экзона, 20 из которых альтернативные (т.е. имеют структурные варианты) и 9 интронов, из которых альтернативных 8 и располагается на второй хромосоме. Исследования последних лет показали, что за измененный характер экспрессии и продукции соответствующих белков ответственны некоторые аллельные ассоциации генов семейства IL-1. Выявлен ряд точечных маркеров гена IL-1β: -3737, -1469, -999, -511, -31, +3953, +3962, однако наиболее изученными являются два полиморфизма гена IL-1β: в промоторной части в положении -511 (С-511Т) и в 5-м экзоне (С3953Т), ассоциированные с измененной экспрессией [3].

Ген IL-6 у человека находится в составе 7 хромосомы на ее коротком плече в участке p15-21 и состоит из 4 экзонов и 5 интронов. В гене IL-6 были обнаружены однонуклеотидные замены, наиболее изучен полиморфный участок промоторной области в точке -174, где происходит замена гуанина на цитозин (-174G/C) [4].

Ген TNFА расположен на 6 хромосоме на ее коротком плече в области p21.3 и содержит 4 экзона. Имеются данные о взаимосвязи полиморфизма гена TNFА с количеством его продукции. Выявлены несколько SNP гена TNFА: -1031T/C, -863C/A и -857C/A, -308G/A и -238G/A. Наиболее изучены два полиморфных варианта гена TNFА: -238G/A -308G/A, имеющие разнонаправленное влияние на продукцию данного цитокина: в положении -308 замена гуанина на аденин повышает продукцию цитокина TNFА, а в точке -238 напротив снижает [1, 6].

Статистическая обработка

Для расчета достоверности различий по частоте встречаемости аллельных вариантов, генотипов, сочетаний генотипов между группами здоровых русских и больных НЯК использовали следующие критерии: для степеней свободы выше 1 - критерий максимального правдоподобия (G или χ2ML), который рассчитывался с помощью иерархического логлинейного анализа; для степени свободы 1 - критерий Пирсона (χ2), применяли χ2 с поправкой Йетса, точный двусторонний критерий Фишера [5].

Оценка достоверности различий в распределении частот генотипов согласно моделям наследования и соответствие закону Харди-Вайнберга проводились с использованием онлайн приложения SNPStats [9].

Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р≤ 0,05, незначимыми при р >0,10; для промежуточных значений р (0,05≤р≤ 0,10) обсуждали тенденцию к различиям.

Результаты исследования

Наблюдаемые в исследовании частоты аллелей и генотипов в выборках больных НЯК и условно-здоровых лиц соответствуют ожидаемым согласно закону Харди-Вайнберга.

На первом этапе анализа было установлено распределение частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма генов IL-1β+3953C/T, IL-6-174G/C, TNFА-308G/A у больных НЯК и контрольной группы русской популяции Челябинской области.

Установлено, что в группе больных снижена частота аллеля с заменой +3953*Т (18,89% против 24,78%, на уровне тенденции). Распределение генотипов полиморфизма гена IL-1B не отличалось между исследуемыми выборками. Наблюдали некоторое повышение гомозиготного генотипа по предковому аллелю, но данные были статистически не достоверны (χ2= 2,48 p= 0,1150). Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма гена IL-1β+3953C/T у больных НЯК и контрольной группы

IL-1β +3953C/T

Больные НЯК

Контроль

достоверность χ2

количество

%

количество

%

аллели

254

 

468

 

T

48

18,89

116

24,78

3,25 p= 0,07

C

206

81,10

352

75,21

Генотипы

127

 

234

 

 

TT

4

3,14

15

6,41

p= 0,22

CT

40

31,49

86

36,75

1,00 p= 0,32

CC

83

65,35

133

56,83

2,48 p= 0,12

 

Согласно анализу моделей наследования предковый генотип С/С ассоциирован с предрасположенностью к НЯК у русских Челябинской области на уровне тенденции. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

Ассоциация полиморфизма +3953 IL-1β+3953C/T с предрасположенностью к НЯК

Модель наследования

Распределение генотипов IL-1β +3953C/T согласно моделям наследования

Уровень значимости

Доминантная

С/С

Т/Т-С/Т

Р=0.091

Рецессивная

Т/Т

С/С – С/Т

Р=0.22

Кодоминантная

Т/Т

С/Т

С/С

Р=0.18

Сверхдоминантная

С/Т

Т/Т - С/С  

Р=0.24

 

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма - 174G/C гена IL-6 характеризовалось незначительными колебаниями частот аллелей (р=0,18) и некоторым повышением носительства гомозиготного генотипа по аллелю с заменой у больных НЯК (26,77% против 19,13% р=0,16), однако данные не достигали статистической значимости (данные не приводятся). Анализ ассоциации полиморфизма IL-6 -174G/C   с предрасположенностью к НЯК при различных моделях наследования также показал отсутствие статистической значимости.

Таблица 4

Ассоциация полиморфизма IL-6 -174G/C с предрасположенностью к НЯК

Модель наследования

Распределение генотипов IL-6 -174G/C согласно моделям наследования

Уровень значимости

Доминантная

G/G

C/C-G/C

р=0.77

Рецессивная

C/C

G/G– G/C

р=0.26

Кодоминантная

C/C

G/C

G/G

р=0.54

Сверхдоминантная

G/C

C/C - G/G

р=0.49

 

Распределение частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма гена TNFА не отличалось между больными НЯК и контрольной группой и не влияет на формирование предрасположенности к НЯК при любой модели наследования (данные не приводятся).

На следующем этапе исследования согласно второй задаче был проведен анализ межгенных взаимодействий в виде комбинаций генотипов с использованием иерархического логлинейного анализа. В ходе которого были составлены комбинации генотипов исследуемых полиморфизмов +3953C/T, -174G/C и -308G/A генов IL-1β, IL-6, TNFА.

Статистически значимым оказалось трехфакторное взаимодействие между генотипами

IL-1β и IL-6 и их ассоциацией с предрасположенностью к НЯК (G=9,0114, 4 степени свободы, p=0,06, тенденция). В связи с чем, проанализирована значимость каждой комбинации генотипов IL-1β и IL-6.

Группа больных НЯК характеризовалась следующими особенностями:

  1. Сниженная частота комбинации С/Т (IL-1b) - G/G (IL-6), несущий гетерозиготный генотип IL-1β (TC), ассоциированный с повышением содержания IL-1b, и гомозиготный по предковому аллелю генотип IL-6 (GG) (7,2% против 15,18 % , p=0,0962, на уровне тенденции);
  2. Повышенная частота комбинации СС (IL-1b) - G/G (IL-6) (18,4% против 8,86% χ2= 2,79, p=0,0947, на уровне тенденции), содержащей гомозиготные по предковым аллелям генотипы, ассоциированные со средним уровнем продукции цитокинов согласно литературным данным.

Трехфакторное взаимодействие между генотипами TNFА и IL-6 а также их ассоциацией с предрасположенностью к НЯК оказалось на границе значимости( G=7,3841, 4 степени свободы, p=0,11), что позволило установить, что у больных НЯК повышена комбинация генотипов TNFА-308G/G - IL-6 -174C/C, содержащая генотип со среднем уровнем продукции TNFА и генотип снижающий продукцию IL-6 (20% против 10,12 %, р=0,095).

Анализ комбинаций генотипов IL-1β – TNFА с предрасположенностью/устойчивостью к НЯК показал отсутствие статистической значимости трехфакторного и входящих в него двухфакторных взаимодействий (G=0,9168, 4 степени свободы, p= 0,9, данные не приводятся).

Таким образом, исследуемые полиморфные гены, вероятнее всего, не имеют решающего значения в формировании восприимчивости к неспецифическому язвенному колиту у русских Челябинской области. Следует отметить, что все значимые комбинации несут генотипы гена IL-6 у больных увеличивается частота комбинаций генотипов ассоциированных со средним и низким уровнем продукции и снижается частота комбинаций с высокопродуктивным аллелем +3953*T гена IL-1β.

По нашему мнению, ведущее значение в реализации предрасположенности/устойчивости отводится IL-6 именно в комбинации генотипов IL-6 и IL-1β, IL-6 и TNFА, однако этот феномен требуют дальнейшего изучения.

Выводы:

  1. Установлено снижение частоты аллеля с заменой +3953*Т IL-1β у больных НЯК (χ2= 3,25 p= 0,0713, на уровне тенденции). В доминантной модели наследования аллель дикого типа +3953*С IL-1β в гомозиготной форме чаще встречается у больных НЯК.
  2. Обнаружено: снижение частоты комбинации гетерозиготного генотипа IL-1β (TC) и гомозиготного по предковому аллелю генотипа IL-6 (GG) (p=0,0962, на уровне тенденции); повышение частоты комбинации гомозиготных по предковым аллелям генотипов IL-1β (CC) и IL-6 (GG) (χ2= 2,79, p=0,0947, на уровне тенденции), повышение частоты комбинации гомозиготного по предковому аллелю генотипа TNFА (GG) и гомозиготного по аллелю с заменой генотипа IL-6 (CC) (χ2=2,79 p=0,0949, на уровне тенденции) у больных НЯК по сравнению с контрольной группой.