Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Несмотря на то, что неспецифический язвенный колит (НЯК) известен более 150 лет, на данный момент нет точной информации относительно его этиологии и патогенеза. Считают, что возможно в основе патологии лежит процесс дискриминации иммунного гомеостаза в толстой кишке – микробиота /эпителиально-иммунно-нервная единица. Значительным звеном в развитии НЯК считают наследственную предрасположенность. Согласно литературным данным, у пациентов с неспецифическим язвенным колитом нарушается баланс между про- и противовоспалительными цитокинами. Дисрегуляция иммунных реакций вызывает чрезмерный синтез и активацию провоспалительных цитокинов, что отражается в повышении концентрации провоспалительных цитокинов, таких как IL-1b, TNFa в слизистой кишечника [7, 8].

Кроме того, по данным Hanaola T. и Yoshimura A., в биоптатах слизистой оболочки толстой кишки у больных НЯК установлено повышение уровня IL-6, коррелирующее со степенью активности воспаления и содержанием острофазовых белков. Согласно данным последних лет, различия в генах, контролирующих защитные реакции организма, могут влиять на уровень продукции кодируемых белков и, тем самым, на характер протекания иммунного ответа. В связи с этим функциональный полиморфизм генов цитокинов представляет значительный интерес, т. к. именно эти белки вносят наибольший вклад в регуляцию иммунитета [2].

При отсутствии главного причинного гена, исследование наследственных основ сводится к установлению комплекса генов, обуславливающих подверженность к сложнонаследуемому заболеванию, в частности к неспецифическому язвенному колиту. Составной частью подобного рода молекулярно-генетических исследований является анализ ассоциаций заболевания с полиморфными вариантами генов-кандидатов, белковые продукты которых, предположительно, могут быть вовлечены в патогенез заболевания.

Цель: сравнительный анализ распределения частот встречаемости аллельных вариантов, генотипов и комбинаций генотипов полиморфизмов генов IL-1β+3953C/T, IL-6-174G/C, TNF-α-308G/A у больных неспецифическим язвенным колитом и здоровых лиц русской популяции Челябинской области.

Задачи:

1. Установить частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфизмов генов IL-1β+3953C/T, IL-6-174G/C, TNFА -308G/A у больных неспецифическим язвенным колитом в сравнении с практически-здоровыми лицами русской популяции Челябинской области.
2. Оценить вклад взаимодействий межгенных комбинаций генотипов генов IL-1β, IL-6, TNFА в предрасположенность/устойчивость к НЯК.

Материалы и методы

Проведенная работа относится к типу ретроспективных исследований «случай–контроль».

Контингент обследуемых лиц. Выборка больных НЯК состояла из 127 человек русской этнической группы с диагнозом НЯК, которые находились на лечении в гастроэнтерологических отделениях Дорожной клинической больницы МПС на станции Челябинск и ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница».

В качестве контрольной группы (234 человек) использовали популяционную выборку, сформированную случайным образом на основе ДНК-банка потенциальных доноров стволовой клетки ГБУЗ «Челябинская областная станция переливания крови», проживающих в г. Челябинске и Челябинской области. Популяционная принадлежность определялась по данным генеалогического анамнеза до третьего поколения (согласно рекомендациям 8-го Международного Симпозиума в 1980 г., Лос-Анджелес, США).

Таблица 1

Демографическая характеристика обследуемых групп

Методы исследования

Эксперимент состоял из следующих этапов:

1. Пробоподготовка – выделение ДНК из цельной крови;
2. ПЦР-амплификация;
3. Детекция – электрофорез и гель-документирование.

В качестве биологического материала для исследования использовалась венозная кровь, взятая в пробирки с 0,5 % раствором калиевой соли этилендиаминтетра уксусной кислоты (ЭДТА). Выделение ДНК проводили с использованием реагентов PROTRANS DNA Box 500. Определение SNPs в полиморфных сайтах +3953C/T, -174G/C и -308G/A генов IL-1β, IL-6, TNFА  проводилось аллель-специфической ПЦР с реактивами ООО НПФ «Литех» г. Москва с последующей УФ-детекцией результатов в 3% агарозном геле.

Характеристика исследуемых генов

Ген IL-1β содержит 22 экзона, 20 из которых альтернативные (т.е. имеют структурные варианты) и 9 интронов, из которых альтернативных 8 и располагается на второй хромосоме. Исследования последних лет показали, что за измененный характер экспрессии и продукции соответствующих белков ответственны некоторые аллельные ассоциации генов семейства IL-1. Выявлен ряд точечных маркеров гена IL-1β: -3737, -1469, -999, -511, -31, +3953, +3962, однако наиболее изученными являются два полиморфизма гена IL-1β: в промоторной части в положении -511 (С-511Т) и в 5-м экзоне (С3953Т), ассоциированные с измененной экспрессией [3].

Ген IL-6 у человека находится в составе 7 хромосомы на ее коротком плече в участке p15-21 и состоит из 4 экзонов и 5 интронов. В гене IL-6 были обнаружены однонуклеотидные замены, наиболее изучен полиморфный участок промоторной области в точке -174, где происходит замена гуанина на цитозин (-174G/C) [4].

Ген TNFА расположен на 6 хромосоме на ее коротком плече в области p21.3 и содержит 4 экзона. Имеются данные о взаимосвязи полиморфизма гена TNFА с количеством его продукции. Выявлены несколько SNP гена TNFА: -1031T/C, -863C/A и -857C/A, -308G/A и -238G/A. Наиболее изучены два полиморфных варианта гена TNFА: -238G/A -308G/A, имеющие разнонаправленное влияние на продукцию данного цитокина: в положении -308 замена гуанина на аденин повышает продукцию цитокина TNFА, а в точке -238 напротив снижает [1, 6].

Статистическая обработка

Для расчета достоверности различий по частоте встречаемости аллельных вариантов, генотипов, сочетаний генотипов между группами здоровых русских и больных НЯК использовали следующие критерии: для степеней свободы выше 1 - критерий максимального правдоподобия (G или χ²_ML), который рассчитывался с помощью иерархического логлинейного анализа; для степени свободы 1 - критерий Пирсона (χ²), применяли χ² с поправкой Йетса, точный двусторонний критерий Фишера [5].

Оценка достоверности различий в распределении частот генотипов согласно моделям наследования и соответствие закону Харди-Вайнберга проводились с использованием онлайн приложения SNPStats [9].

Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р≤ 0,05, незначимыми при р >0,10; для промежуточных значений р (0,05≤р≤ 0,10) обсуждали тенденцию к различиям.

Результаты исследования

Наблюдаемые в исследовании частоты аллелей и генотипов в выборках больных НЯК и условно-здоровых лиц соответствуют ожидаемым согласно закону Харди-Вайнберга.

На первом этапе анализа было установлено распределение частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма генов IL-1β+3953C/T, IL-6-174G/C, TNFА-308G/A у больных НЯК и контрольной группы русской популяции Челябинской области.

Установлено, что в группе больных снижена частота аллеля с заменой +3953*Т (18,89% против 24,78%, на уровне тенденции). Распределение генотипов полиморфизма гена IL-1B не отличалось между исследуемыми выборками. Наблюдали некоторое повышение гомозиготного генотипа по предковому аллелю, но данные были статистически не достоверны (χ2= 2,48 p= 0,1150). Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма гена IL-1β+3953C/T у больных НЯК и контрольной группы

Согласно анализу моделей наследования предковый генотип С/С ассоциирован с предрасположенностью к НЯК у русских Челябинской области на уровне тенденции. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

Ассоциация полиморфизма +3953 IL-1β+3953C/T с предрасположенностью к НЯК

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма - 174G/C гена IL-6 характеризовалось незначительными колебаниями частот аллелей (р=0,18) и некоторым повышением носительства гомозиготного генотипа по аллелю с заменой у больных НЯК (26,77% против 19,13% р=0,16), однако данные не достигали статистической значимости (данные не приводятся). Анализ ассоциации полиморфизма IL-6 -174G/C   с предрасположенностью к НЯК при различных моделях наследования также показал отсутствие статистической значимости.

Таблица 4

Ассоциация полиморфизма IL-6 -174G/C с предрасположенностью к НЯК

Распределение частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма гена TNFА не отличалось между больными НЯК и контрольной группой и не влияет на формирование предрасположенности к НЯК при любой модели наследования (данные не приводятся).

На следующем этапе исследования согласно второй задаче был проведен анализ межгенных взаимодействий в виде комбинаций генотипов с использованием иерархического логлинейного анализа. В ходе которого были составлены комбинации генотипов исследуемых полиморфизмов +3953C/T, -174G/C и -308G/A генов IL-1β, IL-6, TNFА.

Статистически значимым оказалось трехфакторное взаимодействие между генотипами

IL-1β и IL-6 и их ассоциацией с предрасположенностью к НЯК (G=9,0114, 4 степени свободы, p=0,06, тенденция). В связи с чем, проанализирована значимость каждой комбинации генотипов IL-1β и IL-6.

Группа больных НЯК характеризовалась следующими особенностями:

1. Сниженная частота комбинации С/Т (IL-1b) - G/G (IL-6), несущий гетерозиготный генотип IL-1β (TC), ассоциированный с повышением содержания IL-1b, и гомозиготный по предковому аллелю генотип IL-6 (GG) (7,2% против 15,18 % , p=0,0962, на уровне тенденции);
2. Повышенная частота комбинации СС (IL-1b) - G/G (IL-6) (18,4% против 8,86% χ2= 2,79, p=0,0947, на уровне тенденции), содержащей гомозиготные по предковым аллелям генотипы, ассоциированные со средним уровнем продукции цитокинов согласно литературным данным.

Трехфакторное взаимодействие между генотипами TNFА и IL-6 а также их ассоциацией с предрасположенностью к НЯК оказалось на границе значимости( G=7,3841, 4 степени свободы, p=0,11), что позволило установить, что у больных НЯК повышена комбинация генотипов TNFА-308G/G - IL-6 -174C/C, содержащая генотип со среднем уровнем продукции TNFА и генотип снижающий продукцию IL-6 (20% против 10,12 %, р=0,095).

Анализ комбинаций генотипов IL-1β – TNFА с предрасположенностью/устойчивостью к НЯК показал отсутствие статистической значимости трехфакторного и входящих в него двухфакторных взаимодействий (G=0,9168, 4 степени свободы, p= 0,9, данные не приводятся).

Таким образом, исследуемые полиморфные гены, вероятнее всего, не имеют решающего значения в формировании восприимчивости к неспецифическому язвенному колиту у русских Челябинской области. Следует отметить, что все значимые комбинации несут генотипы гена IL-6 у больных увеличивается частота комбинаций генотипов ассоциированных со средним и низким уровнем продукции и снижается частота комбинаций с высокопродуктивным аллелем +3953*T гена IL-1β.

По нашему мнению, ведущее значение в реализации предрасположенности/устойчивости отводится IL-6 именно в комбинации генотипов IL-6 и IL-1β, IL-6 и TNFА, однако этот феномен требуют дальнейшего изучения.

Выводы:

1. Установлено снижение частоты аллеля с заменой +3953*Т IL-1β у больных НЯК (χ2= 3,25 p= 0,0713, на уровне тенденции). В доминантной модели наследования аллель дикого типа +3953*С IL-1β в гомозиготной форме чаще встречается у больных НЯК.
2. Обнаружено: снижение частоты комбинации гетерозиготного генотипа IL-1β (TC) и гомозиготного по предковому аллелю генотипа IL-6 (GG) (p=0,0962, на уровне тенденции); повышение частоты комбинации гомозиготных по предковым аллелям генотипов IL-1β (CC) и IL-6 (GG) (χ2= 2,79, p=0,0947, на уровне тенденции), повышение частоты комбинации гомозиготного по предковому аллелю генотипа TNFА (GG) и гомозиготного по аллелю с заменой генотипа IL-6 (CC) (χ2=2,79 p=0,0949, на уровне тенденции) у больных НЯК по сравнению с контрольной группой.