Одним из перспективных маркеров изменения иммунного статуса, на наш взгляд, является альфа2-макроглобулин (МГ). Это гликопротеид, содержащий 9% углеводов, с молекулярной массой 720-820 кДа, pI - 5,4. Данный белок является одним из ключевых ингибиторов протеиназ, участвующим в регуляции активности многих протеолитических энзимов человеческого организма. Связывание протеиназ осуществляется определенным фрагментом субъединицы МГ, не затрагивая каталитически активного центра фермента [1; 3; 4; 9].
Примерно на десятой неделе внутриутробного развития уровень МГ в сыворотке крови достигает 15% от уровня взрослого и постепенно повышается до нормальных (для взрослого) значений. Максимальный уровень отмечается к 1-3 годам (примерно 4,5 г/л), затем постепенно снижается до стабилизации на уровне, характерном для взрослых к 25 годам. Его концентрация у женщин примерно на 20% выше, чем у мужчин. Средняя концентрация МГ в плазме крови взрослых людей составляет 2,6-3,3 г/л [1; 3; 4].
Согласно современным данным, альфа2-макроглобулин имеет существенное клинико-диагностическое значение. Он является выраженным маркером «острой фазы», концентрация которого тонко реагирует на большинство острых воспалительных заболеваний. Достоверное повышение уровня сывороточного МГ регистрируется при нефротической патологии, а также в случаях раннего отторжения трансплантата. Высокие концентрации белка обнаружены у больных сахарным диабетом, особенно при нарушении функции почек. Снижение уровня МГ регистрируется при вирусном гепатите, остром панкреатите, ревматическом остеоартрозе, на ранних стадиях ожоговой болезни [2; 4; 5; 11].
Ранее нами было отмечено, что средняя концентрация МГ в плазме крови экспоненциально возрастает в течение беременности, достигая максимума в конце ее, что свидетельствует о непосредственном участии в процессе формирования иммунологической толерантности беременности [6; 7].
Кроме того, доказано, что МГ обладает выраженной иммуносупрессивной активностью по отношению к различным звеньям иммунной системы человека. Наиболее сильно выражено иммуносупрессивное действие белка по отношению к лимфоцитам в течение беременности, особенно в первом триместре. Этот белок индуцирует способность макрофагов и нейтрофилов мигрировать в участки воспаления [4; 5; 8-10].
В соответствии с изложенными фактами логично предположить, что МГ является активным компонентом процессов гуморального иммунитета и, следовательно, может выступать в качестве маркера изменений и нарушений иммунного статуса человеческого организма.
Учитывая, что заболевания, сопровождающиеся нарушением иммунитета, составляют обширный пласт современной нозологии, выявление патогенетических звеньев иммунного дисбаланса и разработка новых способов оптимизации качества диагностики подобных патологических состояний путем апробации и внедрения иммунохимического теста на МГ, безусловно, являются актуальной задачей современной медицины.
Цель исследования: количественный иммунохимический анализ сывороточной концентрации МГ при ряде патологических состояний, сопровождающихся изменением иммунного фона, и выявление корреляции количественных показателей с течением патологического процесса.
Материалы и методы исследования
Проведен количественный иммунохимический анализ уровня МГ в пробах сыворотки крови 156 пациентов больных с патологической активацией и супрессией иммунитета, из них: больные туберкулезом – 36 человек, лепрой – 24, ожоговой болезнью – 38, с аутотрансплантацией после ожогов – 11, системной красной волчанкой (СКВ) – 5, здоровые доноры (контрольная группа) - 42.
При разработке способа выделения и очистки МГ применяли методы высаливания глобулинов сульфатом аммония 40%-ной насыщенности, центрифугирование при 6000 об/мин, ионообменную хроматографию на DEAE-сефадексе А-50 в ступенчатом восходящем градиенте ионной силы, рабочий буфер 0,01 М трис-HCl, рН 7,2, гель-проникающую хроматографию на Toyopearl-65, рабочий буфер 0,15 М фосфатный, рН 7,4.
Количественный анализ альфа-2-макроглобулина проводили методом ракетного электрофореза в агаровом геле в варианте Laurell C.B. и Merrill D. с использованием моноспецифической самостоятельно полученной тест-системы на этот белок. Определение концентраций МГ в биоматериале проводилось из расчета порога чувствительности разработанных тест-систем.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием лицензионного пакета прикладных программ статистического анализа Statistica 6.0 (StatSoft. Inc.), с вычислением средних величин (М), средней ошибки средней арифметической (m), критерия Стьюдента (t), значимости различий (p). Для оценки межгрупповой зависимости проводили линейный корреляционный анализ Пирсона (коэффициент корреляции - r). Для оценки статистической значимости показателей концентрации МГ у больных с СКВ использовали способы статистического анализа для малых выборок.
Результаты исследований
На основе полученных ранее данных о физико-химических свойствах МГ [6; 7] разработан оригинальный алгоритм выделения и очистки этого белка. Исходным биоматериалом для этого служила сыворотка крови беременных женщин поздних сроков (36-40 недель гестации), которую получали в МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахани. Способ очистки МГ включал последовательные этапы: высаливание исходного материала сульфатом аммония 40%-ной насыщенности с последующим центрифугированием (6000 g), ионообменную хроматографию на DEAE-сефадексе А-50 (рабочий буфер 0,01 М трис-HCl, рН 7,2) в ступенчатом восходящем градиенте ионной силы, гель-фильтрацию на Toyopearl-65 (рабочий буфер 0,15 М фосфатный, рН 7,4).
Контроль чистоты полученных препаратов осуществляли путем аналитического электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 1).
Рис. 1. Анализ чистоты полученного препарата МГ методом электрофореза в ПААГ.
1 - очищенный препарат МГ, 2 – полуочищенный препарат
Полученные вышеописанным способом очищенные препараты МГ использовали для получения антисывороток путем иммунизации кроликов породы шиншилла дробными дозами чистого антигена с адъювантом Фрейнда по следующей схеме: инъекция включала смесь антигенного материала с полным адьювантом Фрейнда в соотношении 1:2. Смесь вводилась подкожно в боковую поверхность туловища животного в 8 точек. Инъекции проводились четырежды с недельным интервалом. Забор крови осуществлялся из краевой вены уха животного на 6-10-й день после последнего введения.
Если полученные антисыворотки не являлись моновалентными, то для избавления от балластных антител проводили истощение антисыворотки методом аффинной сорбции с фиксированными антигенами (лиофилизированная плазма донора). Данная методика представляет собой собственную модификацию метода связывания белков с полиакриламидным гелем (Bio Gel P-200) при использовании глутарового альдегида.
Абсолютную чувствительность полученных тест-систем определяли как частное концентрации белка в очищенном препарате, определенного биуретовым методом, и максимального рабочего разведения тест-антигена.
В результате проведенной работы разработаны специфические иммунохимические тест-системы на МГ, в которых тест-антигеном является сыворотка крови беременных женщин поздних сроков (35-40 нед) в рабочем разведении: 1/8, с порогом чувствительности 3,95±0,19 мг/л.
Полученные тест-системы использовали, в частности, для определения уровня МГ методом ракетного электрофореза в агаровом геле в варианте Laurell C.B. и Merrill D. в клиническом материале.
Сравнительный анализ сывороточных концентраций МГ показал значительный разброс средних показателей в различных исследуемых нозологических группах (таблица).
Уровни сывороточного МГ в исследуемых группах
|
Исследуемые группы |
Количество проб |
Средняя концентрация МГ (М±m) (мг/л) |
|
Системная красная волчанка |
5 |
80,0±0 |
|
Туберкулез |
36 |
854,6± 92,4 |
|
Лепра |
24 |
451,2±55,9 |
|
Ожоговая болезнь |
38 |
212,1±27,8 |
|
Аутотрансплантация после ожогов |
11 |
121,7±23,0 |
|
Контрольная группа |
42 |
292,3±35,3 |
Анализ результатов по группе больных с туберкулезом позволил выявить достоверное превышение средней концентрации МГ- 854,6 мг/л, по сравнению с группой контроля - 290 мг/л, (t=6,2; p<0,01). Распределение средних величин МГ внутри обследуемой группы больных туберкулезом тоже имело определенную закономерность: при диссеминированных формах туберкулеза и туберкулезе, осложненном плевритом, среднее содержание сывороточного МГ составляло 342,9 мг/л (t=3,9; p<0,05), при фиброзно-кавернозной форме - 946,7 мг/л (t=6,8; p<0,005).
Средние показатели МГ у больных лепрой оказались достоверно повышены – 451,2 мг/л (t=5,8; p<0,01). Хотя при данной патологии повышение исследуемого белка не так значительно, как при туберкулезе.
У пациентов с СКВ средняя концентрация МГ в сыворотке крови оказалась равной 80 мг/л, что значительно ниже средних величин содержания этого белка в контрольной группе (t=5,1; p<0,01).
Контингент обследуемых ожоговых больных был представлен только пациентами с ожогами III-IV степеней и значительной площадью поражения без сопутствующей инфекционной и вегетативной патологии. Анализ полученных результатов показал значительное снижение (до 20 мг/л) уровня сывороточного МГ в начальные стадии ожоговой болезни, нормализацию концентраций этого белка на 4-5-й день процесса и дальнейшее повышение его средних значений до 600-700 мг/л к 10-15 дням ожоговой болезни (t=4,4; p<0,05) (рис. 2). Показана высокая прямая корреляционная зависимость между течением ожоговой болезни и ростом концентрации сывороточного МГ (r = 0,87).
Рис. 2. Динамика изменения концентраций МГ в сыворотке крови при ожоговой болезни
Исследовались также пробы пациентов с аутотрансплантацией кожи на фоне ожогов тяжелой степени (III-IV). Средняя концентрация сывороточного МГ у них составляла – 121,7 мг/л, что значительно ниже нормы (t=4,8; p<0,05).
Полученные данные свидетельствуют о биологической роли альфа-2-макроглобулина как активного фактора иммуносупрессии, уровень сывороточной концентрации которого имеет обратную зависимость от степени активности иммунного статуса человеческого организма (что не противоречит имеющимся в литературе данным), и показывают необходимость внедрения иммунохимического теста на МГ в клиническую лабораторную практику для оптимизации диагностики и повышения контроля качества лечения заболеваний, сопровождающихся изменением иммунитета.
Выводы
1. Полученные данные свидетельствуют о высоком значении МГ как негативного маркера иммунного статуса организма, концентрация которого повышается при заболеваниях, ассоциированных с иммуносупрессией (лепра, туберкулез, разгар ожоговой болезни), и снижается при патологической активации иммунитета (СКВ, ранние стадии ожоговой болезни).
2. Внедрение иммунохимического теста на альфа-2-макроглобулин в клиническую практику позволит оптимизировать диагностику и повысить контроль качества лечения ряда заболеваний, сопровождающихся изменением иммунного статуса.