При системной красной волчанке (СКВ) многими исследователями были отмечены генетически обусловленное несовершенство иммунорегуляторных процессов и различные дефекты апоптоза, которые способны приводить к образованию широкого спектра антител и последующему возникновению иммунокомплексного воспаления [5,6,7]. Для гомеостаза иммунной системы контроль апоптоза имеет решающее значение, а широкий спектр аутоантител, определяемый в сыворотке крови больных СКВ, обусловлен многообразием аутоантигенов, освобождаемых и модифицированных в ходе апоптоза [2,15,17]. Часто мишенью аутоиммунных реакций при СКВ становятся ферменты основных метаболических путей организма – антиоксидантной системы и пуринового метаболизма. Одними из основных энзимов данных систем являются ксантиноксидаза (КО, ЕС 1.1.3.22) и гуаниндезаминаза (ГДА, Е.С. 3.5.4.3).
Цель исследования: совершенствование методов лабораторной диагностики с помощью иммобилизированных магнитоуправляемых антигенных наносистем на основе ксантиноксидазы и гуаниндезаминазы для выделения клинико-иммунологических вариантов СКВ.
Материалы и методы
В исследование были включены 60 больных СКВ (основная группа). Средний возраст больных СКВ составил 36,32±15,27 (М±SD) лет, среди больных СКВ преобладали женщины (91,7 %), большинство составляли лица трудоспособного возраста (90 %), продолжительность СКВ составила 7,97±7,36 лет, средний возраст дебюта болезни – 28,5±13,2 лет. Активность СКВ оценивали с помощью индексов SLEDAI, ECLAM и по критериям, предложенными В.А. Насоновой (низкая – 9, умеренная – 34, высокая – 17 человек). Повреждение (необратимые изменения в состоянии здоровья) измеряли с помощью индекса SLICC/ACR (таблица). При оценке течения СКВ по критериям В.А. Насоновой были получены следующие результаты: у 2 пациентов имело место острое течение СКВ, у 44 – подострое, у 14 – хроническое.
Исходные показатели больных СКВ
Показатель |
M |
SD |
95% ДИ для М |
Возраст дебюта болезни (лет) |
28,6 |
13,18 |
25,19…32,01 |
Продолжительность болезни (лет) |
7,97 |
7,35 |
6,07…9,87 |
Активность: SLEDAI |
8,93 |
5,74 |
7,45…10,4 |
Активность: ECLAM |
5,30 |
2,79 |
4,59…6,01 |
Повреждение: SLICC/ACR DI |
1,95 |
1,71 |
1,51…2,39 |
Примечание: М – среднее значение, SD – стандартное отклонение, ДИ – доверительные интервалы.
В контрольную группу вошли 30 практически здоровых лиц (доноры областной станции переливания крови) в возрасте от 18 до 40 лет (20 женщин и 10 мужчин; средний возраст – 26,0±5,6 лет), прошедших обычное медицинское обследование.
Объектом исследований служила сыворотка крови. Антитела к КО (анти-КО) и ГДА (анти-ГДА) определяли в сыворотке крови по разработанной нами модифицированной методике иммуноферментного анализа с использованием в качестве носителя иммобилизированных магнитоуправляемых антигенных наносистем (АНС), а в качестве антигена – коммерческие препараты КО и ГДА («Sigma», США). Иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля [1]. Результаты проведенных исследований учитывали на многоканальном микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм и выражали в единицах оптической плотности (Ед). Результаты считались положительными при превышении в дублированных образцах средних показателей оптической плотности средних значений нормальных сывороток (лиц контрольной группы) на 3 стандартных отклонения.
Общеклинические лабораторные исследования выполнялись в клинической лаборатории Городской клинической больницы № 25 (г. Волгоград) унифицированными методами в соответствии с ведомственными нормативными документами, регламентирующими порядок их проведения. Был проведен ряд иммунологических проб, позволяющих охарактеризовать иммунный статус больных СКВ, включенных в исследование (иммуноглобулины классов A, M, G, ревматоидный фактор, циркулирующие иммунные комплексы, антинуклеарный фактор, СРБ, антитела к кардиолипину, антитела к нативной ДНК и др.). Анализ исходных клинических и лабораторных данных больных СКВ показал, что изолированные лабораторные показатели не могут быть использованы как индикаторы активности и тяжести течения заболевания, следовательно, необходимо проведение максимально комплексного обследования с привлечением, по возможности, дополнительных диагностических тестов.
Статистический анализ экспериментальных данных выполнялся с помощью программного пакета «STATISTICA 6.0 FOR WINDOWS» (StatSoft Inc., USA). Уровень статистической значимости различий сравниваемых показателей устанавливали с использованием t-критерия Стьюдента; непараметрического U-критерия Манна – Уитни и Т-критерия Уилкоксона. Результат считался достоверным при р<0,05 [8].
Результаты исследования
В группе здоровых лиц содержание (M±SD) анти-КО составило 0,032±0,022 Ед, а анти-ГДА – 0,049±0,021 Ед. Положительными считались результаты, превышающие уровень анти-КО > 0,098 Ед и уровень анти-ГДА > 0,112 Ед. У больных СКВ показатели (М±SD) анти-КО составили 1,31±0,83 Ед, анти-ГДА – 1,27±0,82 Ед. Количество больных СКВ с повышенным уровнем анти-КО и анти-ГДА составило 53,3 % и 51,7 %, соответственно. Повышенный уровень данных антител не был выявлен ни у одного обследованного в контрольной группе.
Содержание анти-КО и анти-ГДА исследовали в зависимости от показателей СКВ, характеризующих развитие патологического процесса на всем его протяжении.
Была установлена значимая связь уровня анти-КО с повреждением, определяемым с помощью индекса SLICC/ACR: коэффициент корреляции составил 0,29 (р=0,022). При сравнении пациентов СКВ, не имевших повреждения (значения индекса равны 0) (n=15, 25%), с больными, имевшую любую степень повреждения (n=45, 75 %) содержание анти-КО было заметно ниже в первой группе больных (0,097±0,056 против 0,14±0,044; р=0,041). При проведении корреляционного анализа была выявлена связь анти-КО с тяжестью поражения почек (r=0,31; p=0,024), а также наличием у больных СКВ цитопенического синдрома (r=0,35; p=0,012). Сравнение между собой групп больных СКВ, позитивных и негативных по наличию анти-КО, продемонстрировало статистически достоверное увеличение частоты выявления признаков поражения почек (р=0,032) и ретикуло-эндотелиальной системы (р=0,021), также была отмечена большая доля больных с наличием васкулопатии среди пациентов с наличием антител к КО (р=0,042).
Между уровнем анти-ГДА в сыворотке крови больных СКВ и активностью патологического процесса была выявлена статистически значимая корреляция (индекс SLEDAI: r=0,361, р=0,012; индекс ECLAM: r=0,333, р=0,011). У больных СКВ также была отмечена отрицательная корреляция уровня анти-ГДА со значениями биохимической активности гуаниндезаминазы в сыворотке крови (r= -0,35). Наиболее высокие уровни анти-ГДА отмечались у больных СКВ с поражением печени (р=0,024) и у больных с выраженным цитопеническим синдромом (р=0,039). Следует подчеркнуть, что в группе больных СКВ, позитивных по анти-ГДА, также статистически значимо чаще выявлялось поражение печени (χ² с поправкой Йетса=18,95, р=0,001) и анемия (χ² с поправкой Йетса=6,92, р=0,009).
Обсуждение полученных результатов
Собственные белки организма в нормальных условиях приводят, как правило, к развитию естественной толерантности, так как основные антигенные детерминанты этих белков распознаются Т-клетками и не могут вызвать образование антител [2]. В случае изменения конформации белка на его поверхности появляются «скрытые эпитопы», то есть такие антигенные детерминанты, которые не участвовали в процессе выработки иммунологической толерантности, а, значит, распознаются как чужеродные антигены [12].
Одной из причин конформационных изменений структуры белка могут явиться активные формы кислорода (АФК) и усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ). При СКВ имеет место накопление АФК, вторичных свободнорадикальных продуктов, которые активно реагируют с молекулами в ближайшем окружении [11], а в результате этих процессов происходит усиление пероксидации мембранных структур и нарастание дефектов в контроле апоптоза клеток. Отмечено, что развитие патологических процессов при СКВ сопровождается нарушением регуляции апоптоза лейкоцитов [9] и нейтрофилов [14], причем снижение уровня апоптоза нейтрофилов сопровождается усилением образования активных форм кислорода и уменьшением резервного потенциала клеток [5]. Дефекты апоптоза приводят к усилению секвестрации аутоантигенов в апоптотические тельца, что в итоге способствует срыву толерантности, созданию «новых эпитопов» и, как следствие, увеличению выработки аутоантител. Чрезмерное образование свободных радикалов при СКВ вызывает повреждение мембран макрофагов, эритроцитов и других клеточных структур [3], а также способствует выходу в экстрацеллюлярное пространство многих биологически активных веществ, в том числе и ферментов, таких как КО и ГДА. Наличие антигенных свойств у ферментов обеспечивает ответную реакцию при их выходе из клетки, а воздействие различных факторов воспаления усиливает антигенные свойства энзимов, вследствие окисления их функциональных групп [4].
Повышение активности прооксидантной КО (О-форма фермента) вследствие повышения проницаемости мембран у больных СКВ способствует выходу из клеток различных протеаз, что также сопровождается генерацией супероксидных радикалов и нарастанием активности КО. О влиянии анти-КО на активность фермента можно судить по выявленной нами прямой корреляции умеренной силы (r= 0,49; p<0,001) между активностью фермента и уровнем данных антител. Принимая во внимание также обнаруженную обратную корреляцию высокой силы (r= -0,64; p<0,001) между активностью КО и активностью ксантиндегидрогеназы (КДГ, D-форма фермента), можно предположить, что при СКВ антитела к КО оказывают определенное влияние на трансформацию КО ↔ КДГ в сторону увеличения образования прооксидантной формы фермента (КО, О-форма фермента). Предположительно это влияние выражается в изменении функциональной активности КО, когда под воздействием антител к КО происходит усиление процессов трансформации D-формы фермента в О-форму, что в итоге ведет к существенному увеличению генерации супероксидных радикалов.
Особый интерес представляют полученные нами данные о зависимости уровня анти-КО от наличия у больных СКВ различных клинических проявлений. При проведении корреляционного анализа была выявлена связь анти-КО с тяжестью поражения почек (p=0,024), а также наличием у больных СКВ цитопенического синдрома (p=0,012).
Наряду с этим, анализ связей уровня анти-КО с лабораторными и иммунологическими показателями также позволил выделить связь слабой и средней силы с индикаторами поражения почек при СКВ – протеинурией (r=0,26; p=0,037), лейкоцитурией (r=0,36; p=0,002) и эритроцитурией (r=0,28; p=0,021), что позволяет рассматривать анти-КО как дополнительный индикатор волчаночной нефропатии. В проведенном нами исследовании поражение почек было крайне разнообразно (от стойкой невыраженной протеинурии и микрогематурии до быстропрогрессирующего гломерулонефрита) и выявлялось у 24 (40 %) больных СКВ, причем у подавляющего большинства (15 человек) волчаночный нефрит развился в течение первых 6 лет от начала заболевания, а у 12 % больных поражение почек было первым проявлением СКВ. Следует отметить, что наибольшие диагностические трудности вызывали больные с поражением почек без иммунологических и морфологических признаков СКВ в первые годы заболевания.
ГДА считается относительно органоспецифичным ферментом для печени, поэтому любая патология данного органа, сопровождаемая гепатоцеллюлярным повреждением, приводит к повышенному выбросу энзима в кровь. В связи с этим нами были исследованы активность ГДА и уровень анти-ГДА в сыворотке крови 9 больных СКВ с признаками патологии печени (изменение осадочных проб, повышения активности АлАТ, АсАТ, общего билирубина, ультразвуковые изменения в паренхиме печени, гепатомегалия и др.). У данной группы больных было отмечено увеличение показателей как активности ГДА (р=0,042), так и анти-ГДА (р=0,034).
Одновременно было проведено исследование ферментативной и иммунологической активности ГДА у 16 больных хроническим гепатитом, которое показало достоверное повышение активности ГДА по сравнению с донорами (p=0,036) и незначительное повышение по сравнению с больными СКВ с признаками поражения печени (p>0,05). Что же касается анти-ГДА, то у больных с хроническим гепатитом мы наблюдали отсутствие статистически значимых различий со здоровыми лицами (р>0,1) и достоверно низкие значения в сравнении с больными СКВ с признаками поражения печени (р=0,006). В связи с этим, при наличии печеночной патологии у больных СКВ в затруднительных случаях необходимо рассматривать факт повышения активности ГДА не только за счет активности патологического процесса, но и вследствие возможного поражения данного органа, ориентируясь, в первую очередь, на уровень анти-ГДА и имеющуюся клиническую картину заболевания.
Появление анти-ГДА в сыворотке крови больных СКВ может свидетельствовать о глубине нарушения анаболических и деструктивных процессов при данном заболевании. Дальнейшее изучение анти-ГДА и выяснение их влияния на биохимическую активность этого фермента у больных СКВ с позиций изучения отдельных звеньев патогенеза заболевания и клинического варианта патологического процесса способно содействовать улучшению выбора метода терапевтического воздействия и контроля эффективности проводимой терапии.
Заключение
Механизмы образования аутоантител при системных заболеваниях соединительной ткани, таких как СКВ, до настоящего времени окончательно не определены. Внедрение новых методов диагностики на основе АНС в лабораторную практику может быть использовано для выявления антител к ферментам, в частности к ферментам пуринового метаболизма, в сыворотке крови больных СКВ, что позволит более точно характеризовать различные клинико-иммунологические варианты течения заболевания, и может предоставить дополнительные возможности для своевременной коррекции терапевтического воздействия. В целом, детальное изучение процессов образования антител к КО и ГДА может быть использовано для составления более полной картины иммунологических нарушений, составляющих основу системных аутоиммунных заболеваний.