Создание новых лекарственных форм противоопухолевых препаратов – задача современная и актуальная. В последние два десятилетия сформировался новый взгляд на липопротеины (ЛП) плазмы крови и их белковые компоненты как на естественные нанопереносчики лекарственных препаратов [6,10]. Показано, что использование липопротеинов высокой плотности в комплексе с даунорубицином приводило к увеличению эффективности транспорта и цитостатического действия препарата в отношении клеток НА-1 гепатомы мышей [5]. В литературе представлены работы, в которых показана возможность использования основного белкового компонента аполипопротеина А-I в качестве транспортной формы лекарственных препаратов [8]. Ранее нами была показана способность аполипоаротеина А-I образовывать устойчивые комплексы с противоопухолевыми препаратами актиномицином Д и винбластином и проникать в цитоплазму и ядра клеток асцитной карциномы Эрлиха [2].
Целью настоящей работы явилось изучение эффективности цитостатического действия аполипопротеина А-I в комплексе с винбластином на модели асцитной карциномы Эрлиха.
МЕТОДИКА. Выделение липопротеинов из плазмы крови человека проводили методом изоплотностного ультрацентрифугирования в растворах KBr в присутствии 3 мМ ЭДТА-Na2 на центрифуге «Optima L-90K, Beckman-Coulter» (Австрия) с использованием ротора 70.1 Ti [4]. Получали три основные фракции липопротеинов: липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП, 0,94
Аполипопротеин А-I выделяли из фракции ЛПВП. Делипидирование проводили охлажденной смесью хлороформ-метанол (1:1) из расчета 20 мл смеси на 1 мл ЛПВП с последующей многократной отмывкой эфиром. Для получения апоА-I (апоА-I) суммарные белки ЛПВП в растворе 3% Ds-Na и 0,1% меркаптоэтанола наносили на колонку (1,6 х 100 см) с Сефарозой 6В-CL («Pharmacia», Швеция) и элюировали 5мМ Трис-НСl буфером, рН 8,6, содержащим 6 М мочевину, 0,01% азид натрия и 1 мМ фенилметансульфонилфторид. Проверка чистоты апоА-I осуществлялась с помощью электрофореза в 10% ПААГ с Ds-Na. Белковые полосы визуализировали 0,1% Кумасси G-250 в смеси метанола и 10% уксусной кислоты (1:1) [4].
Обессоливание апоА-I проводили методом гель-фильтрации (колонка: 40 ´ 0,8 см, Сефадекс G-25 («Pharmacia», Швеция), элюент: 5мМ трис-НСl буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl. Профиль элюции регистрировали на УФ-детекторе при длине волны 280 нм. Концентрация обессоленного белка составляла 0,2 мг/мл.
В работе использовали 1 мМ маточный раствор винбластина (ЛЭНС, ФАРМ, Россия).
Пролиферативную активность клеток оценивали по скорости включения 3Н-тимидина («Amersham», Англия) в ДНК. Последний добавляли в среду инкубации в дозе 2 мкКи/мл за 2 часа до окончания эксперимента. Реакцию останавливали добавлением 0,2н раствора NaOH. Для измерения радиоактивности содержимое лунки переносили на целлюлозные фильтры «Whatman 3 MM» (Англия), которые последовательно промывали от несвязавшейся метки раствором 10% трихлоруксусной кислоты и смесью этанол-эфир (1:1). Радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счётчике «Mark-III»(США) и выражали в имп/мин на 1 мг белка [7]. Содержание белка в образцах определяли по методу Варбурга и Христиана [1].
Эксперименты проводили на клетках асцитной карциномы Эрлиха. Выделение клеток из перитонеального экссудата проводили на 10 день после перевивания. Под легким эфирным наркозом мышей забивали с помощью дислокации шейных позвонков, вскрывали брюшную полость в нижнем латеральном отделе. Собирали перитонеальный экссудат и вносили в центрифужные пробирки. Центрифугировали в течение 10 мин при 150g для осаждения клеточных элементов. Осадок клеток трижды промывали большими объемами холодного раствора Рингера-Кребса. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивали по исключению трипанового синего [3].
Комплекс аполипопротеина А-I с винбластином (апоА-I–винбластин) получали, выдерживая их смесь в молярном соотношении 1:1 в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, в течение 15 мин при комнатной температуре. Комплекс апоА-I–винбластин добавляли к культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха и инкубировали в течении 5 часов. Концентрация апоА-I в среде инкубации составляла от 20 мкг/мл до 5 мкг/мл, винбластина от 1 мкг/мл до 0,1мкг/мл.
В качестве контроля использовали клетки карциномы, которым в среду инкубации добавляли физиологический раствор.
Статистическую обработку данных проводили при помощи программы StatPlus 2009 Professional 5.8.4., (США). Статистическую значимость полученных результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при уровне значимости p<0,05.
Результаты и обсуждение
Из литературы известно, что винбластин (Vinblastine) – алкалоид, содержащийся в растении барвинок розовый (Vinca rosea L.), а также в растении катарантус розовый (Catharanthus roseus L.). Механизм противоопухолевого действия объясняют способностью связываться с молекулами тубулина, торможением образования митозного веретена, и блокированием тем самым деление клетки, т. е. блокирование митоза на стадии метафазы. Рабочие концентрации препарата в экспериментах in vitro составляют в диапазоне от 10 мкг/мл до 0,1 мкг/мл [9]. Мы проводили оценку цитостатического действия в течении пяти часов инкубации. Предварительные эксперименты показали, что антипролиферативный эффект для винбластина без переносчика на модели асцитной карциномы Эрлиха был отмечен при концентрации 1мкг/мл уже через пять часов инкубации. Показано, что добавление в питательную среду аполипопротеина А-I в комплексе с винбластином в той же концентрации (1мкг/мл) так же снижало скорость биосинтеза ДНК рис.1.
Рис.1. Изменение скорости биосинтеза ДНК в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Концентрация винбластина 1 мкг/мл
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,001).
Снижение концентрации цитостатика до 0,1 мкг/мл показало, что в присутствии комплекса аполипопротеина А-I с винбластином скорость биосинтеза ДНК снижалась на 41% . Инкубация при добавлении винбластина без переносчика оставляла значения на уровне контрольных рис.2.
Рис.2. Изменение скорости биосинтеза ДНК в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Концентрация винбластина 0,1 мкг/мл.
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,001)
# - достоверное различие по сравнению с группой винбластин (р < 0,05).
Похожий эффект был получен при использовании концентрации винбластина 0,05 мкг/мл риc. 3. Снижение скорости биосинтеза ДНК при добавлении комплекса составило 23 % по сравнению с контролем. Добавление в среду инкубации винбластина без аполипопротеина А-I оставляло значения на уровне контрольных.
Рис.3. Изменение скорости биосинтеза ДНК в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Концентрация винбластина 0,05 мкг/мл.
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,05)
Дальнейшее уменьшение концентрации цитостатика не выявило влияния комплекса аполипопротеина А-I с винбластином на пролиферацию опухолевых клеток. Таким образом, была определена наименьшая концентрация комплекса, при которой был обнаружен цитостатический эффект.
Полученные результаты позволяют сделать вывод об эффективности цитостатического действия комплекса аполипопротеина А-I с винбластином на модели асцитной карциномы Эрлиха в экспериментах in vitro, поскольку комплекс снижает биосинтез ДНК в опухолевых клетках карциномы при использовании концентраций цитостатика, при которых препарат без переносчика не оказывает влияния на пролиферацию опухолевых клеток.