Pmp-гены, кодирующие полиморфные белки наружной мембраны хламидий (Polymorphic Outer Membrane Proteins – POMPs), включая функционально схожие белки-аналоги группы автотранспортеров, составляют до 14% всего генетического материала микроорганизма [1, 5].
Полиморфные белки наружной мембраны хламидий, в свою очередь, проявляющие высокую имунногенную активность, применяются при создании субъединичной (пептидной) противохламидийной вакцины [3, 8].
Полиморфизм pmp-генов ассоциирован с патогенетическими свойствами хламидий, их вирулентностью и тканевым тропизмом возбудителя [1, 4]. А методы полногеномного секвенирования способствуют раскрытию молекулярных механизмов его патогенеза [5, 7].
Цель настоящей работы – сравнительный молекулярно-генетический анализ pmp-генов штамма хламидий ПП-87, на основе полученных массивов данных полногеномного секвенирования.
Материалы и методы исследования
Экстракция геномной ДНК штамма хламидий ПП-87, выделенного от абортировавшей самки песца [2, 6], и адаптированного к размножению в желточных оболочках куриных эмбрионов, осуществлена набором «ДНК-сорб Б» («ЦНИИ эпидемиологии», Россия).
Создание фрагментной библиотеки выполнено с помощью набора NEBNext DNA Library (NEB, США), где на начальном этапе проводилась фрагментация геномной ДНК с помощью ультразвука на приборе Covaris S2 (Covaris, США). Далее полученные фрагменты обрабатывались Т4 ДНК-полимеразой для получения «тупых» концов и Т4 полинуклеотидкиназой для присоединения фосфата на 5'-конец. На следующем этапе в реакционную смесь был добавлен фрагмент Кленова для присоединения dА на 3'-конец, что позволило провести дальнейшее селективное присоединение к полученным фрагментам с помощью ДНК-лигазы двуцепочечного адаптера, несущего в своей последовательности участки для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования. На последнем этапе проводилась ПЦР для увеличения копийности фрагментов, а также для избавления от концевых некомплементарных участков.
Качество полученной фрагментной библиотеки оценивали с помощью набора High Sensitivity DNA Kit на приборе Bioanalyzer 2100 (Agilent, США). Количество ДНК было определено с помощью набора dsDNA High Sensitivity Kit на флюориметре Qubit 1.0 (Invitrogene, США). Секвенирование фрагментной библиотеки на геномном секвенаторе MiSeq (Illumina, США) проводилось по протоколу производителя с использованием набора MiSeq Reagent Kit, 600 Cycles (Illumina, США) в ЦКП «Геномика» СО РАН (Новосибирск).
Результаты исследований и их обсуждение
В результате секвенирования были получены парные чтения длиной 300+300 нт с общим объемом данных порядка 660 тыс. последовательностей, 80% которых имели качество QV>30, эквивалентное 1 ошибке на 1000 нуклеотидов.
Для последующего анализа последовательности были отфильтрованы по качеству (QV>20), оттриммированы и картированы на референсный геном Chlamydia psittaci GR9 (GenBank A/N: CP003791). При этом, количество ридов, соответствовавших этому геному составило всего 1,6% с его покрытием в среднем 2±1,86. Значительная же доля просеквенированного материала – ДНК Gallus Gallus, послужившая причиной низкого покрытия генома хламидий.
Данное обстоятельство не помешало провести анализ идентичности штамма Chlamydia sp. ПП-87 к штаммам Chlamydia psittaci GR9 (CP003791), Chlamydia psittaci 6BC (CP002549) и Chlamydia abortus S26/3 (CR848038) в процентном выражении выборок локусов pmp-генов, представленный в развернутой табличной форме (табл. 1).
Таблица 1
Анализ идентичности штамма Chlamydia sp. ПП-87 к штаммам C. psittaci GR9, C. psittaci 6BC и C. abortus S26/3 в процентном выражении выборок локусов pmp-генов
|
Chlamydia sp. ПП-87 vs Chlamydia psittaci 6BC |
GR 6BC |
Chlamydia sp. ПП-87 vs Chlamydia psittaci GR9 |
GR9 S26/3 |
Chlamydia sp. ПП-87 vs Chlamydia abortus S26/3 |
|
complement(217354..222747) /gene="pmp1B" /locus_tag="CPSIT_0231" /product="polymorphic outer membrane protein B family" (219145-219769) 92% (222386-222832) 100% |
97 % |
complement(217331..222727)
/locus_tag="B598_0234" /product="autotransporter beta-domain protein (219034-219659) 100% (222275-222721) 100% |
92 % |
complement(217265..222631) /gene="pmp1B" /locus_tag="CAB200" /product="polymorphic outer membrane protein" (218971-219591) 95% (222188-222625) 87% |
|
complement(223038..225839) /gene="pmp2A" /locus_tag="CPSIT_0232" /product="polymorphic outer membrane protein A family" (223082-223375) 99% (225356-225839) 100% |
99 % |
complement(222927..225728)
/locus_tag="B598_0235" /product="autotransporter beta-domain protein" (222971-223264) 100% (225245-225728) 100% |
92 % |
complement(222833..225634) /gene="pmp2A" /locus_tag="CAB201" /product="polymorphic outer membrane protein" (222877-223170) 95% (225153-225634) 93% |
|
complement(293986..296988) /gene="pmp3E" /locus_tag="CPSIT_0297" /product="polymorphic outer membrane protein E family" (293986-294231) 95% (296305-296867) 91% |
90 % |
complement(293489..296485)
/locus_tag="B598_0301" /product=”autotransporter beta domain protein” (293489-293734) 99% (295801-296366) 100% |
86 % |
complement(293548..296514) /gene="pmp3E" /locus_tag="CAB265" /product="polymorphic outer membrane lipoprotein" (293548-293793) 86% (295829-296395) 72% |
|
complement(297010..299895) /gene="pmp4E" /locus_tag="CPSIT_0298" /product="polymorphic outer membrane protein E family" (297010-297564) 89% (299258-299895) 100% |
96 % |
complement(296507..299392)
/locus_tag="B598_0302" /product="autotransporter beta-domain protein" (296507-297061) 100% (298755-299392) 100% |
82 % |
complement(296536..299397) /gene="pmp4E" /locus_tag="CAB266" /product="polymorphic outer membrane protein" (296536-297090) 88% (298751-299397) 83% |
|
complement(300162..301226) /gene="pmp5E" /locus_tag="CPSIT_0300" /product="polymorphic outer membrane autotransporter beta-domain protein" (300162-301226) 99% |
99 % |
complement(299660..300724)
/locus_tag="B598_0303" /product="autotransporter beta-domain protein"
(299660-300724) 99% |
81 % |
complement(299664..300743) /gene="pmp5E" /locus_tag="CAB267" /product="polymorphic outer membrane protein"
(299664-300743) 81% |
|
complement(301687..304641) /gene="pmp6H" /locus_tag="CPSIT_0301" /product="polymorphic outer membrane protein H family" (301687-303038) 97% (304190-304641) 98% |
96 % |
complement(301185..304139)
/locus_tag="B598_0305" /product="autotransporter beta-domain protein (301185-302539) 100% (303688-304139) 99% |
88 % |
complement(301197..304139) /gene="pmp6H" /locus_tag="CAB268" /product="polymorphic outer membrane protein" (301197-302548) 88% (303691-304139) 93% |
|
complement(304667..307798) /gene="pmp7G" /locus_tag="CPSIT_0302" /product="polymorphic outer membrane protein G family"
(304667-305146) 99% (306510-307228) 93% |
96 % |
complement(304165..307284)
/locus_tag="B598_0306" /product="outer membrane autotransporter barrel domain protein" (304165-304644) 100% (306005-306714) 100% |
88 % |
complement(304165..307239) /gene="pmp7G" /locus_tag="CAB269" /product="polymorphic outer membrane protein"
(304165-304644) 94% (305993-306669) 87% |
|
complement(308031..310586) /gene="pmp8G" /locus_tag="CPSIT_0304" /product="polymorphic outer membrane protein G family"
(308059-308652) 99% (310248-310586) 99% |
99 % |
complement(307518..310073)
/locus_tag="B598_0307" /product="autotransporter beta-domain protein"
(307546-308139) 99% (309735-310073) 100% |
88 % |
complement(307520..310121) /gene="pmp8G" /locus_tag="CAB270" /product="polymorphic outer membrane protein (pseudogene)" (307548-308141) 90% (309735-310070) 91% |
|
complement(310842..313676) /gene="pmp9G" /locus_tag="CPSIT_0305" /product="polymorphic outer membrane protein G family"
(310922-311474) 99% (312659-313254) 94% |
96 % |
complement(310328..313162)
/locus_tag="B598_0308" /product="autotransporter beta-domain protein"
(310408-310960) 100% (312145-312740) 100% |
86 % |
complement(310327..313154) /gene="pmp9G" /locus_tag="CAB273" /product="polymorphic outer membrane protein (pseudogene)" (310407-310959) 89% (312137-312732) 86% |
|
complement(313808..316330) /gene="pmp10G" /locus_tag="CPSIT_0306" /product="polymorphic outer membrane protein G family" (313808-314672) 99% (314724-315874) 99% |
99 % |
complement(313293..315815)
/locus_tag="B598_0309" /product="autotransporter beta-domain protein" (313293-314157) 100% (314209-315359) 100% |
92 % |
complement(313284..315806) /gene="pmp10G" /locus_tag="CAB277" /product="polymorphic outer membrane protein" (313284-314148) 93% (314200-315350) 92% |
|
complement(316486..319020) /gene="pmp11G" /locus_tag="CPSIT_0307" /product="polymerase outer membrane protein G family"
(316684-317838) 99% (318465-319035) 99% |
99 % |
complement(315971..318520)
/locus_tag="B598_0310" /product="outer membrane autotransporter barrel domain protein" (316169-317323) 100% (317950-318520) 99% |
91 % |
complement(315962..318511) /gene="pmp11G" /locus_tag="CAB278" /product="polymorphic outer membrane protein"
(316160-317314) 91% (317941-318511) 93% |
|
complement(319411..321975) /gene="pmp12G" /locus_tag="CPSIT_0309" /product="polymorphic outer membrane protein G family"
(320158-320380) 95% (320910-321881) 77% |
81 % |
complement(319496..321508)
/locus_tag="B598_0313" /product=" chlamydia polymorphic membrane middle domain protein" (319706-319928) 96% (320444-321414) 100%\
(319706-319928) 96% (320444-321414) 100% |
79 % |
complement(318850..321371) /gene="pmp12G" /locus_tag="CAB279" /product="polymorphic outer membrane protein (pseudogene)" (319597-319819) 88% (320340-321277) 71%
(319597-319819) 88% (320340-321277) 71% |
|
complement(324766..327309) /gene="pmp14G" /locus_tag="CPSIT_0311" /product="polymorphic outer membrane protein G family" (325513-325735) 98% (326251-327215) 93% |
93 % |
|||
|
complement(322106..324637) /gene="pmp13G" /locus_tag="CPSIT_0310" /product="polymorphic outer membrane protein G family"
(322122-322933) 84% (323411-324637) 77% |
79 % |
complement(321639..322565) /locus_tag="B598_0314" /product="autotransporter beta-domain protein" complement(322936..324195) /locus_tag="B598_0315" /product=" chlamydia polymorphic membrane family protein" (321655-322466) 98% (322951-324195) 97%
(321655-322466) 98% (322951-324195) 97% |
82 % |
complement(321502..324045) /gene="pmp13G" /locus_tag="CAB281" /product="polymorphic outer membrane protein
(321518-322326) 83% (322815-324045) 80%
(321518-322326) 83% (322815-324045) 80% |
|
complement(327440..330007) /gene="pmp15G" /locus_tag="CPSIT_0312" /product="polymorphic outer membrane protein G family" (327456-328267) 97% (328754-330007) 91% |
95 % |
|||
|
complement(324766..327309) /gene="pmp14G" /locus_tag="CPSIT_0311" /product="polymorphic outer membrane protein G family"
(325669-326162) 24% (326221-326878) 50% |
46 % |
complement(324319..327099)
/locus_tag="B598_0317" /product="outer membrane autotransporter barrel domain protein" (325207-325700) 100% (325762-326422) 99%
(325207-325700) 100% (325762-326422) 99% |
93 % |
complement(324168..326948) /gene="pmp14G" /locus_tag="CAB282" /product="polymorphic outer membrane protein"
(325056-325549) 93% (325611-326271) 91%
(325056-325549) 93% (325611-326271) 91% |
|
complement(330131..332827) /gene="pmp16G" /locus_tag="CPSIT_0313" /product="polymorphic outer membrane protein G family" (331019-331512) 99% (331574-332234) 99% |
99 % |
|||
|
complement(327440..330007) /gene="pmp15G" /locus_tag="CPSIT_0312" /product="polymorphic outer membrane protein G family"
(327748-329521) 6% |
23 % |
complement(327243..331313)
/locus_tag="B598_0318" /product="outer membrane autotransporter barrel domain protein" (329154-330840) 100%
(329154-330840) 100% |
88 % |
complement(327092..331228) /gene="pmp15G" /locus_tag="CAB283" /product="polymorphic outer membrane protein"
(329012-330665) 84%
(329012-330665) 84% |
|
complement(333055..335394) /gene="pmp17G" /locus_tag="CPSIT_0314" /product="polymorphic outer membrane protein G family" (334963-336639) 89% complement(335706..337112) /gene="pmp18G" /locus_tag="CPSIT_0316" /product="polymorphic outer membrane protein G family" |
93 % |
|||
|
complement(330131..332827) /gene="pmp16G" /locus_tag="CPSIT_0313" /product="polymorphic outer membrane protein G family"
(331233-332229) 1% |
0 % |
691252..693760
/locus_tag="B598_0667" /product="chlamydia polymorphic membrane family protein" (691297-692233) 96%
(691297-692233) 96% |
81 % |
683361..685902 /gene="pmp16G" /locus_tag="CAB596" /product="polymorphic outer membrane protein (pseudogene)" (683406-684366) 81%
(683406-684366) 81% |
|
707548..710061 /gene="pmp19G" /locus_tag="CPSIT_0666" /product="polymorphic outer membrane protein G family" (707593-708529) 96% |
99 % |
|||
|
complement(333055..335394) /gene="pmp17G" /locus_tag="CPSIT_0314" /product="polymorphic outer membrane protein G family"
(334613-335042) 0% |
1 % |
693891..695195
/locus_tag="B598_0669" /product="chlamydia polymorphic membrane family protein" (694155-694553) 90%
(694155-694553) 90% |
79 % |
686033..688552 /gene="pmp17G" /locus_tag="CAB598" /product="polymorphic outer membrane protein"
(686282-686680) 84%
(686282-686680) 84%
(687836-688439) 90% |
|
710192..712741 /gene="pmp20G" /locus_tag="CPSIT_0667" /product="polymorphic outer membrane protein G family" (710456-710854) 90% |
100 % |
|||
|
712872..715415 /gene="pmp21G" /locus_tag="CPSIT_0668" /product="polymorphic outer membrane protein G family" (714699-715302) 99% |
100 % |
695847..696563
/locus_tag="B598_0671" /product="autotransporter beta-domain protein" (695847-696450) 99% |
91 % |
|
|
complement(926701..931305) /gene="pmp22D" /locus_tag="CPSIT_0856" /product="polymorphic outer membrane protein D family"
(926975-927345) 91% (930464-931055) 89% |
90 % |
complement(902244..906845)
/locus_tag="B598_0860" /product="outer membrane autotransporter barrel domain protein" (902518-902888) 100% (906001-906592) 100% |
98 % |
complement(899562..904163) /gene="pmp18D" /locus_tag="CAB776" /product="polymorphic outer membrane protein"
(899836-900206) 96% (903319-903910) 97% |
Данные, представленные в таблице 1, послужили основой для построения обобщенной таблицы анализа гетерогенности штамма ПП-87 к штаммам GR9, 6BC и S26/3 (табл. 2).
Таблица 2
Анализ гетерогенности штамма Chlamydia sp. ПП-87 к штаммам C. psittaci GR9, 6BC и C. abortus S26/3 в процентном выражении выборок локусов pmp-генов
|
Штамм |
Гетерогенность выборок локусов генов pmp1B-pmp9G |
||||||||
|
S26/3 |
5-13% pmp1B |
5-8% pmp2A |
14-28% pmp3E |
12-17% pmp4E |
19% pmp5E |
3-12% pmp6H |
6-13% pmp7G |
9-10% pmp8G |
11-14% pmp9G |
|
GR9 |
0% |
0% |
0-1% |
0% |
1% |
0-1% |
0% |
0-1% |
0% |
|
6BC |
0-8% pmp1B |
0-1% pmp2A |
5-9% pmp3E |
0-11% pmp4E |
1% pmp5E |
2-3% pmp6H |
1-7% pmp7G |
1% pmp8G |
1-6% pmp9G |
|
Штамм |
Гетерогенность выборок локусов генов pmp10G-pmp22D |
||||||||
|
S26/3 |
7-8% pmp10G |
7-9% pmp11G |
12-29% pmp12G |
17-20% pmp13G |
7-9% pmp14G |
16% pmp15G |
19% pmp16G |
10-16% pmp17G |
3-4 pmp18D |
|
GR9 |
0% |
0-1% |
0-4% |
2-3% |
0-1% |
0% |
4% |
1-10% |
0% |
|
6BC |
1% pmp10G |
1% pmp11G |
8-23% pmp12G (2-7%) (pmp14G) |
16-23% pmp13G (2-3%) (pmp15G) |
50-76% pmp14G (1%) (pmp16G) |
94% pmp15G (11%) (pmp17G) (pmp18G) |
99% pmp16G (4%) (pmp19G)
|
100% pmp17G [1-10%) (pmp20G) [pmp21G] |
(9-11%) (pmp22D)
|
Вышеприведенный анализ гетерогенности/идентичности по выборкам локусов pmp-генов (табл. 2/1) наглядно продемонстрировал близкородственное сходство штамма ПП-87 к референсному штамму Chlamydia psittaci GR9, но с существенными нуклеотидными различиями, достигающими 10% гетерогенности по отношению к соответствующему локусу B598_0669 штамма GR9 (выборка: 694155-694553 nt).
Полученный результат выравнивания соответствующих нуклеотидных последовательностей, отраженный на рисунке 1, проведенный с целью прояснения причины вышеотмеченной существенной гетерогенности, указывает на возможное эволюционное формирование анализируемого локуса pmp-гена штамма ПП-87 под влиянием межштаммовой/межгенной pmp рекомбинации.
Рис. 1. Выравнивание нуклеотидных последовательностей локуса pmp17G/pmp20G-гена штаммов Chlamydia sp. ПП-87 (Query), Chlamydia psittaci GR9 (CP003791), Chlamydia abortus S26/3 (CR848038) и локуса pmp13G-гена Chlamydia psittaci WC (CP003796).
Примечания: Серым цветом выделены последовательности штаммов GR9 и WC, гомологичные соответствующим последовательностям штамма ПП-87.
Дополнительный анализ гетерогенности референсного штамма GR9 к штаммам 6BC и S26/3 в процентном выражении pmp-генов показал меньшую гетерогенность (или большую идентичность) GR9 к 6BC по подавляющему большинству анализируемых генов, за исключением pmp18D-гена штамма S26/3, к которому штамм GR9 по соответствующему локусу B598_0860 проявляет наиболее близкородственное сходство, нежели чем к аналогичному pmp22D-гену 6BC (табл. 3).
Таблица 3
Анализ гетерогенности штамма C. psittaci GR9 к штаммам С. psittaci 6BC и C. abortus S26/3 в процентном выражении pmp-генов
|
Штамм |
Гетерогенность выборок локусов генов pmp1B-pmp9G |
||||||||
|
S26/3 |
8% pmp1B |
8% pmp2A |
14% pmp3E |
18% pmp4E |
9% pmp5E |
12% pmp6H |
12% pmp7G |
12% pmp8G |
14% pmp9G |
|
6BC |
3% pmp1B |
1% pmp2A |
10% pmp3E |
4% pmp4E |
1% pmp5E |
4% pmp6H |
4% pmp7G |
1% pmp8G |
4% pmp9G |
|
Штамм |
Гетерогенность выборок локусов генов pmp10G-pmp22D |
||||||||
|
S26/3 |
8% pmp10G |
9% pmp11G |
21% pmp12G |
18% pmp13G |
7% pmp14G |
12% pmp15G |
19% pmp16G |
9-21% pmp17G |
2% pmp18D |
|
6BC |
1% pmp10G |
1% pmp11G |
19% pmp12G |
21% pmp13G |
54% pmp14G |
77% pmp15G |
100% pmp16G |
99% pmp17G |
(10%) (pmp22D)
|
|
(7%) (pmp14G) |
(5%) (pmp15G) |
(1%) (pmp16G) |
(7%) (pmp17G) (pmp18G) |
(1%) (pmp19G) |
(0%) (pmp20G) [pmp21G] |
||||
Следует отметить, что по анализируемым выборкам (902518-902888 nt, 906001-906592 nt) локуса B598_0860 штамм GR9 имеет 100% идентичность с ПП-87, который, в свою очередь, аналогично референсному штамму, тоже проявляет близкородственное сходство к S26/3 (pmp18D-ген, локус CAB776, выборки: 899836-900206 nt, 903319-903910 nt), нежели чем к 6BC (pmp22D-ген, локус CPSIT_0856, выборки 926975-9273 nt, 45930464-931055 nt) (табл. 1).
Заключение
Таким образом, установлено, что проанализированные в данной работе pmp-гены, кодирующие полиморфные белки наружной мембраны штамма Chlamydia sp. ПП-87, имеют наряду с референсным штаммом Chlamydia psittaci GR9 по подавляющему большинству представленных генов близкородственное сходство к типовому штамму Chlamydia psittaci 6BC, нежели чем к штамму Chlamydia abortus S26/3, за исключением pmp18D-гена последнего, являющегося одним из ключей к раскрытию молекулярных механизмов развития инфекционного процесса с обоснованием патогенеза хламидийной инфекции, ассоциированной с колонизацией плаценты хозяина внутриклеточным паразитом, и прояснению эволюции хламидий.
Рецензенты:
Госманов Р.Г., д.вет.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана, г. Казань.
Якупов Т.Р., д.вет.н., доцент кафедры биологической и неорганической химии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана, г. Казань.