Имеются публикации, отражающие динамику СРБ и при физиологическом процессе – беременности.
Установлено, что у здоровых беременных женщин уровень СРБ в крови возрастает с 16-ой до 28-ой недели, потом снижается. Вторая волна повышения содержания СРБ отмечается непосредственно перед родами [9]. Есть и иная точка зрения, что беременность не влияет на содержание СРБ [5].
Немногочисленны сведения о реакции СРБ на раздражители неантигенной природы, не приводящие к повреждению тканей, в частности на болевое раздражение.
Самостоятельный интерес представляет феномен боли при родах. Является ли боль тяжким испытанием или имеет в своей основе позитивное содержание, в частности, активацию факторов врожденного иммунитета?
Цель исследования: изучение содержания СРБ крыс до и после нормальных родов, и родов, которым предшествовало алгогенное воздействие, а также у приплода, находящегося в утробе матери и после рождения, как в первой, так и во второй группе подопытных животных.
Материал и методы исследования
Боль при родах носит висцеральный и соматический характер [3]. Поэтому острую боль 3–4 степени интенсивности моделировали путем электрокожного раздражения рецепторной зоны корня хвоста крыс с одновременным раздражением прямой кишки через параллельно включенные электроды электрическим током, генерируемым электростимулятором ЭСУ-2 со следующими параметрами: частота тока – 100Гц; амплитуда тока – 30 В; длительность импульса – 500 мс; задержка импульса – 2 мс и время стимуляции – 2 минуты. Электростимуляцию проводили трижды с интервалом 3 часа на 21 день беременности.
На основании анализа поведенческих и вегетативных реакций подопытных животных оценивали интенсивность болевого раздражения в соответствии с общепринятыми критериями [1, 2, 7].
С целью получения сыворотки крови декапитировались интактные животные, интактные беременные животные накануне родов, и после болевой стимуляции накануне родов, а также на первые, третьи и пятые сутки после родов, а также особи приплода, находящиеся в чреве матери, новорожденные крысята на первые, третьи и пятые сутки после рождения от самок обеих подопытных групп. В связи с дефицитом крови у плодов крыс и новорожденных крысят, кровь собиралась в одну пробирку от всех особей одного помета.
Содержание СРБ в крови определяли методом иммуноферментного анализа, с помощью наборов фирмы BD Biosciences (USA). Растворы стандартов конъюгата промывочного буфера приготавливали по инструкции, прилагаемой к набору. Во все лунки рабочего планшета, покрытого моноклональными кроличьими антителами к СРБ крыс, вносили по 100 мкл стандартных растворов и предварительно разведенных образцов сыворотки крови крыс (1:4000). Планшет накрывали, инкубировали при комнатной температуре 30 минут. По окончании инкубации лунки планшета промывали пять раз промывочным буфером с помощью устройства MULTIWASH LABSYSTEMS (Finland). После промывки во все лунки планшета вносили по 100 мкл конъюгата и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Далее во все лунки вносили по 100 мкл ТМБ субстратного раствора, инкубировали 10 минут в темноте при комнатной температуре, останавливали цветную реакцию добавлением в каждую лунку по 100 мкл раствора фосфорной кислоты. Измерение оптической плотности опытных проб 450 нм и обсчет результатов проводили на фотометре MULTISCAN MS LABSYSTEMS (Finland). В компьютерное обеспечение прибора вводили численное значение концентрации СРБ в стандартных растворах и после измерения и пересчета в соответствии разведением 1:4000 получили концентрацию исследуемого вещества в опытных пробах нг/мл.
Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакетов программ MS Office Excel 2010 Pro, STATISTICA 8.0. Числовые данные представлены в виде средних значений со стандартной ошибкой среднего (М±m). Для сравнения двух независимых выборок использовался критерий Манна – Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Содержание С-реактивного белка у интактных крыс, не получавших болевую стимуляцию до родов и после них
Содержание С-реактивного белка в крови интактных не беременных крыс составляет 442,400±28,310 нг/мл.
У беременных самок в крови накануне родов содержание С-реактивного белка составляет 433,800±20, 631 нг/мл.
Статистический анализ показал, что сам факт беременности у крыс не вызывает существенного изменения в содержании С-реактивного белка. По литературным данным у женщин к концу беременности содержание СРБ повышается [9]. Не исключено, что сохранение содержания СРБ стабильным является особенностью крыс.
Первые сутки после родов ознаменовались некоторым увеличением содержания СРБ у самок. Его уровень составил 529,200±23,316 нг/мл (0,05<р<0,1). Такое различие не является существенным, тем не менее статистическая обработка материала позволяет говорить о тенденции повышения изученного субстрата.
На третьи сутки содержание СРБ составило 575,200±19,218 нг/мл, имеется очевидное увеличение определяемого протеина (р<0,05), которое является значимым.
На пятые сутки содержание СРБ составляет 402,400±16,233 нг/мл. Это самое низкое значение из всех определенных, тем не менее расценивать его как снижение СРБ оснований нет, (р>0,05) по отношению к контрольной группе. Статистический анализ показывает, что содержание СРБ возвращается к контрольным значениям.
Содержание С-реактивного белка у стимулированных крыс до родов и после них.
Как было описано выше, содержание С-реактивного белка у интактных не беременных крыс составляет 442,400±28,310 нг/мл.
После болевой стимуляции накануне родов содержание С-реактивного белка в крови беременных крыс составляет 438,800±18,552 нг/мл (р>0,05).
Таким образом, накануне родов содержание СРБ как у стимулированных крыс, так и у не стимулированных остается неизменным.
На первые сутки после родов отмечается увеличение уровня СРБ до 556,200±20,727 нг/мл. Прирост подтверждается статистически, он значим (р<0,05).
На третьи сутки после родов присутствие С-реактивного белка в крови животных достигает 629,200±20,727 нг/мл. Это увеличение по сравнению с контрольными значениями статистически значимо (р<0,05).
На пятые сутки отмечается «обвальное» снижение исследуемого субстрата. Уровень СРБ составил 356,800±26,645 нг/мл – это снижение очевидно по отношению к значениям зарегистрированных на первые и третьи сутки после родов. По отношению к значениям контрольной группы, это снижение следует расценивать лишь как тенденцию (р<0,05<0,1).
Таким образом, полученный фактический материал и сравнение его результатов между группой интактных беременных крыс и группой крыс, испытавших алгогенное воздействие накануне родов, свидетельствует о том, что сам факт беременности не сопровождается нарастанием содержания СРБ в периферической крови вне зависимости от того, получили ли беременные крысы болевую стимуляцию или нет.
После же родов, при сохранении вектора реакции в обеих группах сравнения, следует отметить, что у стимулированных крыс содержание С-реактивного белка нарастает на первые сутки, тогда как у интактных крыс намечается лишь тенденция этого увеличения.
На третьи сутки в обеих группах подопытных животных зарегистрирован очевидный прирост содержания СРБ. На пятые сутки у интактных крыс содержание СРБ не отличается от контрольных значений, а у стимулированных животных отмечается даже тенденция к падению уровня СРБ по сравнению с контрольными значениями.
Общее заключение сводится к двум позициям.
Первая беременность не сопровождается увеличением содержания СРБ.
Вторая, имеет место увеличение содержания СРБ после родов. У интактных животных это увеличение менее интенсивно и к пятым суткам возвращается к исходным значениям. У стимулированных крыс прирост наблюдается более стремительно, а к пятым суткам отмечено снижение содержания СРБ ниже конкретных значений.
Содержание С-реактивного белка у приплода, рожденного от крыс, не получавших болевую стимуляцию накануне родов
У приплода, находившегося в чреве матери, накануне родов содержание С-реактивного белка составило 29,60±7,66 нг/мл.
Вопреки сведениям, опубликованным в литературе, это почти на порядок ниже, чем у взрослых животных. Принято считать, что печень как новорожденных, так и взрослых особей одинаково подготовлена к биосинтезу С-реактивного белка [8]. В наших экспериментах это не нашло подтверждения, во всяком случае для потомства крыс.
В первые сутки после рождения уровень СРБ выше, чем перед родами, и составляет 60,00±27,90 нг/мл. Казалось бы, это очевидное увеличение показателя, но оно не находит своего статистического подтверждения. Различия незначимы (р>0,05).
На третьи сутки после родов содержание СРБ в крови новорождённых несколько снижается. Оно равно 49,10±20,62 нг/мл (р>0,05). На пятые сутки цифровые значения содержания СРБ выше контрольных и предыдущих. Они составляют 121,60±44,99 нг/мл, но и в том и другом случае различие по сравнению с контрольными значениями не существенно (р>0,05).
Таким образом, у приплода, рожденного интактными животными, статистически значимых колебаний в уровне СРБ как во внутриутробном состоянии, так и после родов не отмечено.
Содержание С-реактивного белка у приплода, рожденного от крыс, получивших накануне родов болевую стимуляцию
Содержание С-реактивного белка в крови приплода, находящегося в чреве матери до ее электроболевой стимуляции, составляет 29,60±7,66 нг/мл. У приплода, матери которых непосредственно перед родами получили электроболевую стимуляцию, содержание С-реактивного белка в крови повысилось до 56,40±17,96 мг/мл, однако, статистический анализ этот факт не подтверждает (р>0,05).
В первые сутки после родов у крысят в крови содержится 56,00±15,06 мг/мл исследуемого субстрата, что также не является его увеличением по сравнению с контрольными значениями (р>0,05).
На третьи сутки содержание СРБ составляет 59,60±26,39 мг/мл, т.е. в течение трех суток после родов значения содержания СРБ достаточно монотонны.
На пятые сутки содержание СРБ у новорожденных крысят составило 145,800±47,691 мг/мл, что втрое выше, чем в контрольной группе. Считать это реакцией прироста нельзя, так как различие не является статистически значимым (р>0,05).
Результаты исследования содержания СРБ у пятисуточных крысят выявило крайнюю неоднородность показателей, различие достигало двух порядков, что и повлияло на результат статистического анализа.
Таким образом, ни болевое сопровождение родов, ни нормальные роды не повлияли на содержание С-реактивного белка у приплода, его следует считать стабильным. Обращает на себя внимание тот факт, что на пятые сутки отмечается мозаичность показателей, что делает ряд наблюдений неоднородным и не позволяющим сделать сколько-нибудь определенного заключения.
В процессе беременности, судя по научной литературе, уровень ИЛ-6 – индуктора выработки СРБ, остается неизмененным, с этим очевидно связан монотонный уровень содержания СРБ до родов и сразу после них.
Следует упомянуть относительно недавно появившееся сообщение о том, что у женщин со сроком беременности 37 и более недель повышается уровень ИЛ-6 в сыворотке крови [4]. По логике это должно приводить к нарастанию уровня СРБ, ни тот, ни другой показатель в нашей версии эксперимента статистически значимо не изменялся.
Выводы:
1. Изменение содержания СРБ у интактных самок и получивших накануне родов электроболевую стимуляцию существенных отличий не имеет.
2. У приплода до родов и после рождения содержание СРБ не меняется вне зависимости от того, получали или не получали их матери накануне родов электроболевую стимуляцию.
Рецензенты:Рымашевский А.Н., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии №1 ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России, г. Ростов на Дону;
Харсеева Г.Г., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой микробиологии и вирусологии №2 ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России, г. Ростов на Дону.