Цель работы
Провести сравнительный анализ эффективности противоопухолевой терапии доксорубицином при его введении с помощью магнитоуправляемых липосом у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1.
Материалы и методы исследования
Для получения МЛ использовали яичный фосфотидилхолин (ФХ) и холестерин (ХС) (Sigma Aldrich, США), а также ферромагнитные наночастицы (МНЧ), представляющие собой коллоидный раствор магнетита Fe3O4. МНЧ получали по методу Elmar соосаждением магнетита из растворов сульфата железа (II) и хлорида железа (III) в щелочной среде с последующей стабилизацией олеинатом натрия. Магнитолипосомальный доксорубицин получали по методу обращения фаз [1].
Исследование проводилось на нелинейных половозрелых лабораторных крысах массой 230–250 г. В исследовании использован штамм холангиоцеллюлярной карциномы РС-1 из коллекции НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Интактным животным массой 80–100 г под кожу передней брюшной стенки перевивали ~ 7*106 опухолевых клеток, полученных от животного-опухоленосителя.
В зависимости от характера проводимой терапии животные были разделены на 5 групп (1 контрольную и 4 опытных), по 10 особей в каждой. В опытных группах на 14-й день после перевивки начинали лечение. Препараты вводили внутривенно трехкратно в дозе 6 мг/кг с интервалом в 2 суток. В 1-й вводили внутривенно доксорубицин (ДРЦ), во 2-й и 3-й – доксорубицин, инкорпорированный в липосомы, содержащие наночастицы магнетита (МЛ-ДРЦ), в 4-й-магнитные липосомы (МЛ). В 3-й и 4-й группах непосредственно после введения препарата над областью опухоли создавали магнитное поле (МП) с помощью постоянного магнита NdFeB N38 с силой отрыва 900 Н. Время экспозиции МП составляло 3 часа. На 35-е сутки после начала лечения животных забивали.
Проводили динамический контроль следующих показателей: динамика роста опухолей в каждой группе животных; индекс массы опухоли; индекс торможения роста опухоли, рассчитываемый по формуле: ИТРО=(Mк – Мо)/Мк*100, где Мк и Мо – средняя масса опухоли соответственно в контрольной и опытных группах.
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием критерия t Стьюдента и критерия χ2.
Результаты исследования и их обсуждение
Итоги исследования эффективности противоопухолевой химиотерапии приведены в таблице 1.
Таблица 1
Эффективность противоопухолевой химиотерапии при различных формах введения
|
Группа |
Характер терапии |
ИМО |
ИТРО |
|
Контроль |
- |
34±0,9 1,2,3 |
- |
|
1 |
ДРЦ 6 мг/кг |
20,1±1,8 0,3,4 |
65,4 |
|
2 |
МЛ-ДРЦ 6 мг/кг (без МП) |
17,2±2,2 0,2,3,4 |
70,6 |
|
3 |
МЛ - ДРЦ 6 мг/кг (+ МП) |
8,5±0,9 0,1,2,4 |
82,5 |
|
4 |
МЛ + МП |
31±0,8 1,2,3 |
1,2 |
Примечание: 0 – достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного в контрольной группе; 1 – достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного в 1-й опытной группе; 2 – достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 2-й опытной группе; 3 – достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 3-й опытной группе; 4 – достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 4-й опытной группе.
Как видно из таблицы, исследуемый штамм карциномы РС-1 проявил достаточную чувствительность к доксорубицину: в 1-й опытной группе (водный раствор ДРЦ в дозе 6 мг/кг) индекс торможения роста опухоли составил 65,4 %. Противоопухолевый эффект при использовании МЛ-ДРЦ без применения МП (2-я опытная группа) был эквивалентным таковому у водного раствора доксорубицина. ИТРО в данной группе был равен 70,6 %. ИМО составил 17,2 % и достоверно отличался от такового в контрольной группе.
Эффективность МЛ-ДРЦ в дозе 6 мг/кг с применением МП (3-я опытная группа) была несколько большей. ИТРО был равен 82,5 %, что в 1,2 раза больше показателя 1-й опытной группы. МЛ без доксорубицина (4-я опытная группа) показали свою неэффективность: ИТРО составил 1,2 %.
С целью более детальной оценки динамики роста опухоли у животных проводились измерения объема опухоли каждые 5 дней во время лечения и вплоть до 35 дня эксперимента или гибели животного. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Динамика роста карциномы РС-1 по объему (см3)
|
Дни |
Контроль |
1 группа |
2 группа |
3 группа |
4 группа |
|
10 |
0,46±0,06 |
0,45±0,09 |
0,5±0,08 |
0,49±0,08 |
0,48±0,08 |
|
15 |
1,12±0,09 |
1,12±0,1 |
0,52±0,07* |
0,51±0,05* |
1,10±0,08 |
|
20 |
13,35±0,34 |
8,05±0,04 |
4,03±0,09* |
1,98±0,07* |
13,34±0,44 |
|
25 |
48,38±0,55 |
15,08±0,52* |
10,46±0,2* |
3,36±0,19* |
48,44±0,45 |
|
30 |
72,46±0,64 |
26,42±0,61* |
14,29±0,47* |
6,97±0,25* |
71,41±0,14 |
|
35 |
78,8±1,1 |
30,5±1,05* |
22,94±0,59* |
13,1±0,69* |
77,9±1,15 |
Примечание : * – показатель достоверно (р<0,05) отличается от показателя контрольной группы.
Как видно из таблицы, все использованные формы препарата оказывали лечебный эффект, который заключался в замедлении роста опухоли. Полученные результаты позволили произвести математическое моделирование этого процесса. Как известно [5] , на ранних стадиях рост опухоли описывается экспоненциальным уравнением вида
М = Мо е k t,
где М – масса опухоли (либо количество опухолевых клеток), Mо – начальная (критическая) масса опухоли, k –константа скорости роста, t – время.
На рисунке 1 приведены результаты аппроксимации показателей массы опухоли вышеприведенным уравнением и значения коэффициентов Мо и k.
Рис.1. Результаты аппроксимации показателей массы опухоли
Мы можем видеть, что применение химиотерапии во всех группах уменьшало скорость роста опухоли, но не останавливало его полностью. При этом в эффективность химиотерапии возрастала в ряду «Водный ДРЦ – МЛ-ДРЦ – МЛ-ДРЦ+МП», о чем свидетельствовало прогрессивное уменьшение значения константы скорости. Применение магнитных липосом без химиопрепарата не оказывало значимого влияния на константу скорости. Близость значений показателя Мо в группах объясняется одинаковыми условиями эксперимента: химиотерапия и наблюдение во всех группах начинались через одинаковые сроки после перевивки опухоли.
Еще одним интересным фактом, выявленным при анализе зависимости массы от времени в сравниваемых группах, было торможение роста опухоли на поздних этапах в группах без применения ДРЦ и при использовании его водного раствора. Об этом свидетельствовало меньшее значение фактической массы опухоли по сравнению с теоретически предсказанной. В вышеозначенных группах масса опухоли к моменту окончания эксперимента достигла критического значения, при котором нарушается трофика опухолевого узла и замедляется его рост или начинается спонтанный некроз. В эту стадию развития опухоли, как правило, значительно снижается ее доступность для химиопрепаратов. В группах, где использовался МЛ-ДРЦ (как с применением МП, так и без него), на момент окончания эксперимента масса опухоли, при которой начинается аутоингибиция ее роста, не достигалась.
Анализируя динамику опухолевого роста, необходимо остановиться на влиянии неопластического процесса на состояние организма опухоленосителя. Интегральным показателем направленности обменных процессов является вес тела. В таблице 3 приведены абсолютные значения веса животных сравниваемых групп и его изменения в процессе наблюдения.
Таблица 3
Абсолютные значения веса животных в группах
|
Группа |
Вес животных до начала эксперимента |
Вес животных по окончании эксперимента (с опухолью) |
Индекс массы опухоли |
Вес животного «без опухоли» |
% снижения массы тела |
|
257±10,4 |
264±11,4 |
34±0,9 1,2,3 |
174±9,1 |
32,32,3 |
|
|
1 (Водный раствор ДРЦ, 6 мг/кг) |
265±10,1 |
248±11,1 |
20,1±1,8 0,3,4 |
198±9,9 |
25,3 2,3,4 |
|
2 (МЛ-ДРЦ 6 мг/кг без МП) |
251±11,4 |
221±12,0 |
17,2±2,2 0,2,3,4 |
203±9,8 |
19,10,1,3,4 |
|
3 (МЛ-ДРЦ 6 мг/кг + МП) |
249±9,8 |
254±11,1 |
8,5±0,9 0,1,2,4 |
232±10,1 |
6,80,1,2,4 |
|
4 (МЛ + МП) |
261±10,1 |
259±10,7 |
31±0,8 1,2,3 |
179±9,1 |
31,4 2,3 |
Примечание: 0 – достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного в контрольной группе; 1 – достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного в 1-й опытной группе; 2 – достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 2-й опытной группе; 3 –достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 3-й опытной группе; 4 – достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 4-й опытной группе.
Мы можем видеть, что во всех группах отмечалось снижение веса организма без опухоли, которое в группах животных, не получавших ДРЦ, достигало степени кахексии (32,3 % в контрольной и 31,4 % в 4-й опытной группе). На фоне химиотерапии наименее выраженным снижение веса было в группе, получавшей МЛ-ДРЦ применением МП (6,8 %, р<0,05), в группе МЛ-ДРЦ оно составило 19,1 % (р<0,05), в группе водного ДРЦ – 25,3 % (р<0,05).
Заключение
Таким образом, наиболее эффективным антинеопластическим эффектом обладал магнитолипосомальный доксорубицин, вводимый на фоне создания в зоне опухоли магнитного поля. Применение данной формы лекарственного противоопухолевого препарата повышает эффективность химиотерапии, обеспечивая увеличение индекса торможения роста опухоли на 126 % по сравнению с водорастворимой и на 116 % по сравнению с магнитолипосомальной формой препарата без применения магнитного поля.
Рецензенты:Зорькина А.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой амбулаторно-поликлинической терапии с курсом общественного здоровья и организации здравоохранения Медицинского института ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева» Минобрнауки России, г. Саранск;
Муляр А.Г., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, г. Москва.