Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

EXPERIMENTAL RESEARCH OF HYDROXYAPATITE AND METAL NANOPARTICLES ANTIMICROBIAL ACTIVITY IN VITRO

Shpinyak S.P. 1 Barabash A.P. 1 Lyasnikova A.V. 2 Shunova A.V. 1
1 Federal Government-Financed Institution “Saratov Research Institute of Traumatology and Orthopaedics” of Ministry of Public Health of the Russian
2 FSBEI HPO “Saratov State Technical University named after Yu. A. Gagarin”
Возникновение параимплантарной инфекции после тотального эндопротезирования суставов значительно снижает качество жизни пациента, приводит к необходимости неоднократных оперативных вмешательств, в положительном исходе которых хирург не может быть до конца уверенным. Кроме того, существенно возрастает степень риска рецидивирования, воспаления при последующем ревизионном эндопротезировании, что делает сохранение функции сустава невозможным и приводит к стойкой инвалидизации больного. Исследования по созданию покрытий для медицинских имплантатов, обладающих высокой бактерицидной активностью и препятствующих формированию резистентности у патогенных микроорганизмов, сегодня являются перспективным направлением медицинской науки и могут открыть новую страницу в профилактике и лечении инфекционных осложнений тотального эндопротезирования. Наиболее распространенными возбудителями перипротезной инфекции являются грамположительные St. aureus и St.epidermidis (50-70%). Нами исследована антимикробная активность гидроксиаппатита (ГА) с включением в состав наночастиц различных металлов in vitro в отношении штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от пациентов с инфекционными осложнениями тотального эндопротезирования коленного сустава.
The onset of paraimplantary infection after total joint replacement significantly decreases patients’ life quality and leads to the need in repetitive surgical interventions and a surgeon cannot be completely sure in their positive outcome. Besides the level of inflammation recurrence risk in subsequent revisionary endoprosthesis replacement increases substantially which makes joint function retention impossible and results in constant disablement. Researches on creating medical implant coverings favoring anti-resistance in pathogenetic microorganisms and having high antimicrobial activity are on the scientific foreground today. These studies may turn over a new leaf in preventive and general treatment of infectious complications after total joint replacement. Most common agents of periprostheric infection are Gram-positive St. aureus and St. epidermidis (50-70%). We have studied antimicrobial activity of hydroxyapatite combined with various metal nanoparticles in vitro to Staphylococcus aureus strains obtained from the patients with infectious complications after total knee replacement.
endoprosthesis
infection
hydroxyapatite
nanoparticles
Staphylococcus aureus

Развитие медицинской науки, в особенности в области биокомпозитных материалов, позволило эффективно использовать полиметилметакрилат в качестве матрицы для создания длительно-существующего депо антибиотика, что сразу нашло широкое распространение в лечении гнойно-воспалительных заболеваний опорно-двигательной системы, в частности – глубокой перипротезной инфекции [1; 4; 6]. Наиболее широкое применение в качестве антимикробного агента в составе спейсеров получили лекарственные химиопрепараты (гентамицин, ванкомицин и тобрамицин, реже цефалоспорины, другие аминогликозиды и пенициллины). Предпринимаются попытки внедрить в состав ПММА антисептики или частицы галогенов, металлов, обладающих антимикробной активностью, но эти работы пока единичны [2; 7; 9; 10].

Учитывая данные о том, что эллюция антибиотика происходит только из поверхностных слоев ПММА, а значит, распределенное по всему объему действующее вещество остается интактным в отношении патогенных микроорганизмов и не выполняет свою основную функцию [5], нам представляется перспективным разработка покрытий, способных сочетать бактерицидные и бактериостатические свойства наравне с высокой степенью биосовместимости с тканями организма.

Синтетический чистый гидроксиапатит, (Сa10(PO4)6(OH)2), является неорганическим основным компонентом костной ткани, разрешенным для нанесения на хирургические имплантаты. Материал инертен к тканям человека, малотоксичен и при его применении не наблюдается побочных явлений (воспаления, аллергии, мутагенного действия). Регулируя обмен кальция и фосфора, является матриксом костных тканей с неорганической природой, усиливает пролиферацию остеобластов и ускоряет процесс репаративного остеогенеза в месте его введения [3; 8].

Цель исследования. Исследовать in vitro антимикробные свойства покрытий на основе гидроксиапатита и наночастиц различных металлов по отношению к выделенным у больных с глубокой перипротезной инфекцией коленного сустава штаммам Staphylococcus aureus.

Материалы и методы. В качестве экспериментальных образцов применялся порошок гидроксиаппатита с добавлением наночастиц металлов. Синтез замещенных порошков (степень замещения до 20%) проводился методом осаждения из водных растворов по реакции при комнатной температуре t = 20º С и влажности воздуха 58%, pH раствора поддерживался на уровне 9-12. Полученный в результате синтеза осадок оставляли на созревание на 24 часа в химическом стакане, фильтровали и сушили, затем далее в течение 6 часов прокаливали при температуре 600 ºС. Полученный порошок охлаждали при комнатной температуре в течение суток, после чего размалывали в керамической ступе нажатием пестика и выполняли фракционирование с применением сит.

Плазменное напыление полученных порошков производилось на полуавтоматической установке УПН-28 в лаборатории кафедры ФМБИ СГТУ им. Гагарина Ю.А. Покрытие формировалось последовательным нанесением порошка титана (дисперсность до 350 мкм, дистанция напыления 150 мм, ток дуги плазмотрона 350 А) и ГА покрытием и порошка замещенного ГА (дисперсность до 90 мкм, дистанция напыления 50 мм, ток дуги плазмотрона 300 А).

Исследование ИК-спектров, замещенных ГА порошков проводилось с применением Фурье-спектрометра FT-801 в интервале волновых чисел 500…4000 см -1, таблетки с KBr. По итогам анализа ИК-спектров, замещенных ГА установлено, что образцы порошков в основном соответствует образцу синтетического ГА.

На рисунке 1 представлена сканирующая электронная микроскопия плазмонапыленных покрытий на основе порошков, замещенных ГА. На поверхности частиц преимущественно округлой формы имеются скопления наночастиц различных размеров. Так, для напыленных порошков Mg-ГА и Si-ГА выявлены редкие частицы размерами порядка 40-50 нм, собранные в агломераты размерами до 200 нм. Для плазмонапыленных цинк-, медь, сереброзамещенных ГА покрытий характерно большое скопление наночастиц округлой формы размерами около 50 нм.

В качестве основной группы применены комбинации гидроксиаппатита с наночастицами меди, серебра, магния и цинка (№1 - Cu-ГА, №3 – Ag-ГА, №4 – Mg-ГА, №6 – Zn-ГА). В качестве группы сравнения выбраны образцы ГА без примесей (№5) и с включением наночастиц кремния (№2 – Si-ГА), заведомо не обладающие антимикробной активностью. В эксперименте использованы образцы в виде порошка и в виде покрытия, нанесенного на пластины из медицинского титана, размерами 5х5х2 мм.

В качестве основной группы применены комбинации гидроксиаппатита с наночастицами меди, серебра, магния и цинка (№1 - Cu-ГА, №3 – Ag-ГА, №4 – Mg-ГА, №6 – Zn-ГА). В качестве группы сравнения выбраны образцы ГА без примесей (№5) и с включением наночастиц кремния (№2 – Si-ГА), заведомо не обладающие антимикробной активностью. В эксперименте использованы образцы в виде порошка и в виде покрытия, нанесенного на пластины из медицинского титана, размерами 5х5х2 мм.

А

Б

В

 

Г

Д

 

Рис.1. Сканирующая электронная микроскопия микроскопия плазмонапыленных покрытий на основе порошков, замещенных ГА: А) Mg-ГА; Б) Zn-ГА; В) Si-ГА; Г) Cu-ГА; Д) Ag-ГА.

Микробиологическое исследование образцов с различными типами напыления проводилось на базе отделения лабораторной диагностики ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Минздрава России.

Для изучения антимикробных свойств различных типов напыления были получены суточные культуры штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от пациентов с инфекционными осложнениями после эндопротезирования крупных суставов.

Полный перечень штаммов микроорганизмов, использованных при исследовании антимикробных свойств образцов приведён в таблице 1.

Таблица 1

Штаммы микроорганизмов, использованных в работе

Обозначение

Название

Источник получения

ATCC 25923

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Типовой штамм (музейный)

131

Staphylococcus aureus 131

Раневое отделяемое

139

Staphylococcus aureus 139

Раневое отделяемое

149

Staphylococcus aureus 149

Раневое отделяемое

150

Staphylococcus aureus 150

Раневое отделяемое

161

Staphylococcus aureus 161

Раневое отделяемое

168

Staphylococcus aureus 168

Раневое отделяемое

169

Staphylococcus aureus 169

Раневое отделяемое

173

Staphylococcus aureus 173

Раневое отделяемое

241

Staphylococcus aureus 241

Раневое отделяемое

237

Staphylococcus aureus 237

Раневое отделяемое

237/14

Staphylococcus aureus 237/14

Раневое отделяемое

237/15

Staphylococcus aureus 237/15

Раневое отделяемое

Штаммы стафилококков выращивали на плотных питательных средах
(5%-й кровяной агар «Himedia», Индия) при 37 °С в течение 1-2 суток. Использованные в работе штаммы по морфологическим и культурально-биохимическим свойствам являлись типичными представителями вида Staphylococcus aureus.

Учитывая то, что бактерии рода Staphylococcus относятся к агентам IV группы патогенности, работа с ними проводилась в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных инфекций».

Определение чувствительности бактерий к антимикробному воздействию образцов с напылением проводили на пластинах агара Мюллер-Хинтон («Himedia», Индия) и в пробирках с сахарным бульоном (МПБ + 0,2 % глюкозы). Для посева на чашки из суточных бактериальных культур готовили бактериальные взвеси в 0,15 М NaСl (pН 7,0). Для стандартизации бактериальных взвесей использовали нефелометр Densi La METER («Erba Lachema», Чехия). Полученные взвеси соответствовали мутности 0,5 по Мак-Фарланду. Перед внесением микроорганизмов в бульон добавляли навеску соответствующего образца (50 мг). После получения суспензии в бульон вносили 100 мкл бактериальной взвеси. Инкубацию проводили при температуре 37 °С в течение 24 часов. В качестве отрицательного контроля использовали пробирки с суспензией образца без добавления бактериальной взвеси.

Аликвоты бактериальных взвесей наносили на поверхность агара и растирали по всей поверхности стерильным L-образным шпателем. Посевы подсушивали и помещали на их поверхность с помощью прокалённого над пламенем спиртовки пинцета образцы титановых пластин и нанесенных на них покрытий ГА с наночастицам различных веществ. В пробирки с сахарным бульоном вносили 0,1 мл суспензии бактерий, куда также помещали образцы.

Чашки и пробирки с образцами помещали в термостат для инкубации при 37°С в течение одних суток. Учёт результатов образцов в виде напыления на титановые пластины производили через 20 - 24 ч путём учёта наличия зоны задержки роста в чашках с агаром и видимого изменения мутности в бульонных культурах. По окончании инкубации для визуализации антибактериальной активности образцов в виде порошка проводили высев из пробирок с бульоном на чашки с 5%-м кровяным агаром. Результаты оценивали через 20 - 24 ч путём учёта различий количества выросших колоний на чашках с агаром.

Результаты. Результаты исследования материалов, напыленных на титановые пластины.

В результате проведённых наблюдений выявлена чувствительность большинства исследуемых штаммов Staphylococcus aureus к антимикробному действию образца с напылением Ag-ГА при росте на плотных питательных средах (рис. 2А), в отношении бульонной культуры подобный эффект не регистрировался. Напыление Zn-ГА в 50% случаев также демонстрировало антибактериальную активность в отношении данных микроорганизмов как при инкубации на агаре, так и в бульоне – визуально отмечалась большая прозрачность бактериальной взвеси с этим образцом по сравнению с другими (рис.2Б).

А

Б

Рис.2. Примеры антимикробного действия образцов напыления: А) Зоны задержки роста вокруг образцов на среде Мюллер-Хинтон; Б) Суточная бульонная культура (сахарный бульон): визуально – меньшая мутность в пробирке с образцом № 6.

Полученные результаты изучения воздействия образцов с напылением на штаммы золотистого стафилококка отражены в табл. 2.

Таблица 2

Наличие зоны задержки роста

 

ОБРАЗЕЦ

 

ШТАММ

№1

Сu-ГА

№2

Si-ГА

№3

Ag-ГА

№4

Mg-ГА

№5

ГА

№6

Zn-ГА

S.aureus 139

-

-

+

-

-

+

S.aureus 150

-

-

+

-

-

-

S.aureus168

-

-

+

-

-

-

S.aureus 169

-

-

-

-

-

-

S.aureus 173

-

-

+

-

-

+

S.aureus 237/14

-

-

+

-

-

+/-

S.aureus 237/15

-

-

-

-

-

+/-

S.aureus 237/15 (бульонная культура)

-

-

-

-

-

+/-

Отрицательный контроль

0

0

0

0

0

0

Результаты исследования материалов в виде порошка.

Посевы из пробирок с образцом Ag ГА демонстрировали скудный рост колоний бактерий в сравнении со сплошным ростом на чашках с другими образцами. На основании данного наблюдения можно судить о проявлении антибактериальной активности этого образца в отношении Staphylococcus aureus. На чашках с «отрицательными контролями» роста бактерий выявлено не было (рис. 3).

А

Б

Рис. 3. Типы роста St. aureus: А) «скудный» - слева, «единичные колонии» - справа; Б) «сплошной рост»

В результате проведённого эксперимента выявлена чувствительность большинства исследуемых штаммов Staphylococcus aureus к антимикробному действию образца с напылением AgГА при росте в сахарном бульоне с суспензией образца.

Полученные результаты изучения воздействия образцов порошков на штаммы золотистого стафилококка отражены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты высева на плотные питательные среды бульонной культуры после суточной инкубации с суспензией образца

 

Результат (инкубация 24 часа)

образец

Штаммы Staphylococcus aureus

Сu-ГА

Si-ГА

Ag-ГА

ATCC 25923

сплошной рост

сплошной рост

единичные колонии

131

сплошной рост

сплошной рост

единичные колонии

139

сплошной рост

сплошной рост

единичные колонии

149

сплошной рост

сплошной рост

скудный рост

150

сплошной рост

сплошной рост

единичные колонии

161

сплошной рост

сплошной рост

единичные колонии

168

сплошной рост

сплошной рост

единичные колонии

173

сплошной рост

сплошной рост

скудный рост

241

сплошной рост

сплошной рост

скудный рост

237

сплошной рост

сплошной рост

единичные колонии

отрицательный контроль

отсутствие роста

отсутствие роста

отсутствие роста

 

 

Результат (инкубация 24 часа)

образец

Штаммы Staphylococcus aureus

Mg-ГА

Zn-ГА

ГА

ATCC 25923

сплошной рост

сплошной рост

сплошной рост

131

сплошной рост

сплошной рост

сплошной рост

139

сплошной рост

сплошной рост

сплошной рост

149

сплошной рост

сплошной рост

сплошной рост

150

сплошной рост

сплошной рост

сплошной рост

161

сплошной рост

сплошной рост

сплошной рост

168

сплошной рост

сплошной рост

сплошной рост

173

сплошной рост

сплошной рост

сплошной рост

241

сплошной рост

сплошной рост

сплошной рост

237

сплошной рост

сплошной рост

сплошной рост

отрицательный контроль

отсутствие роста

отсутствие роста

отсутствие роста

Заключение. Изготовление принципиально новых конструкций на основе различных материалов с нанесением на их поверхность биокомпозиционных покрытий различной толщины, состава и пористости, способных обеспечить контролируемую доставку антимикробного агента в параимплантарные ткани, является перспективным направлением научно-исследовательской работы, результаты которой найдут применение не только в травматологии и ортопедии.

Решением рассматриваемой проблемы является применение электрофизических (плазменные, лазерные, ультразвуковые, ионно-лучевые) и электрохимических технологий формирования наноструктурированных биокерамических покрытий с заданными структурно-морфологическими и физико-химическими характеристиками. Высокая эффективность полученных материалов в лечении перипротезной инфекции может быть обеспечена импрегнацией пористой структуры сформированной пространственной конструкции активными субстанциями биологического и синтетического происхождения, которые будут доставляться в прилежащие ткани в течение заданного периода времени.

Немаловажное значение имеет создание методологии индивидуального подбора конструкции и структуры поверхности имплантатов для замещения дефектов костной ткани различной этиологии и формы. Помимо этого в составе покрытий могут использоваться металлозамещенные гидроксиапатиты (Cu, Zn и Ag-содержащие) и бемит (минерал из класса гидроокислов с химической формулой γ-AlO(OH)), которые отличаются повышенной бактерицидной активностью. Усиление бактерицидного эффекта также возможно за счет дополнительного введения в состав материала химиопрепарата с направленным антимикробным действием в зависимости от этиологии возбудителя у конкретного пациента.

Не смотря на значительную роль St. aureus и St.epidermidis в развитии иплантат-ассоциированной инфекции, всегда необходима предварительная верификация возбудителя с определением его чувствительности к антибиотикам для определения антимикробного препарата выбора при изготовлении спейсеров, что вместе с дебридментом полости сустава обеспечит эффективную деконтаминацию раны.

Рецензенты:

Павленко Н.Н., д.м.н., ведущий научный сотрудник Отдела инновационных проектов в травматологии и ортопедии ФГБУ «СарНИИТО» Минздрава России, г. Саратов;

Богатов В.Б., д.м.н., старший научный сотрудник Отдела инновационных проектов в травматологии и ортопедии ФГБУ «СарНИИТО» Минздрава России, г. Саратов.