У исследователей мультифакториальныеболезни привлекают особое внимание, поскольку имеют генетическую компоненту, но при этом не подчиняются менделевскому наследованию (одна мутация – одна болезнь). Такие болезни рассматривают как результат взаимодействия большого числа факторов генетической природы и среды обитания, в том числе возраста, пола итабакозависимости[10]. Появлению генетически обусловленных заболеваний способствует спонтанная или индуцированная нестабильность генома, сопровождающаяся мутациями в нескольких генах. Феномен нестабильности генома, как любое биологическое явление, может иметь негативное или позитивное значение для организма. Поэтому важную роль в исследованиях играет изучение изменений в геноме [2,5].
Метод ДНК-комет впервые был предложен P.Ostling и K.Johanson в 1984г., является быстрым и чувствительным способом, позволяющим оценивать интегральную целостность генома, а также получать адекватную информацию об общем уровне повреждения ДНК клеток [3, 9]. Не вызывает сомнения, что спонтанная нестабильность ДНК различается в клетках различных тканей и органов, однако остается открытым вопрос о том, какие из нихявляютсянаиболее чувствительными индикаторами для различных генотоксикантов[1].
Кроме того, отмеченоповышение уровня разрывов ДНК при аутоиммунных, нейродегенеративных, генетически детерминированных, злокачественных, острых инфекционных и ряде других мультифакториальныхзаболеваний по сравнению со здоровыми людьми [1,3]. Подобныеисследования у больных псориазом, получающих различные виды иммуносупрессивной терапии, не проводились.Примерных нормативов уровня поврежденности ДНКмононуклеарных клеток крови в доступной литературе мы не обнаружили, что весьма затрудняет применение это перспективного метода диагностики в практике работы врача, в частности дерматовенеролога.
Все это явилось поводом для проведения настоящего исследования, имеющего своей целью изучениевозможностей метода ДНК-комет в дополнительной диагностике и оптимизации лечения псориаза.
Материалы и методы
Для достижения цели нами были решены следующие задачи: 1) определен фоновый уровень поврежденности ДНК больных псориазом в сравнении с контрольной группой здоровых лиц, 2) оценены различия уровня поврежденности ДНК у лиц разного возраста, пола и в зависимости от вредной привычки – курения, 3)предложены примерные границы референтного интервалауровня поврежденности ДНКмононуклеарныхклеток крови для здоровых некурящих лиц.
В настоящее время общепризнано, что табачный дым является самым распространенным из доказанных канцерогенов для человека и одной из основных причин заболеваемости, инвалидности и смертности. В целом ряде специальных опытов и исследований была убедительно подтверждена способность компонентов табачного дыма образовывать с ДНК мутагенные аддукты, которые могут приводить к генетической нестабильности с повышенной вероятностью появления и накопления мутаций или другим повреждениям клеточных генов [6]. Однако в работе Арутюняна Р. М. отмечено, что повышение уровня повреждений ДНК в группе курящих по сравнению с некурящими было получено в эксфолиативных клетках слизистой ротовой полости, но аналогичное исследование в лимфоцитах дало противоречивые результаты. Результаты оценки уровней повреждений ДНК в различных возрастных группах тоже противоречивы, однако большинство из них свидетельствует об отсутствии корреляции частоты ДНК-комет с возрастом [1].Поэтому для разработки примерных границ референтного интервалауровня поврежденности ДНК были взяты мононуклеарные клетки периферической крови группы некурящих доноров от 18 до 60 (73 человека, 38мужчин и 35женщин).
В исследовании приняли участие73 больных псориазом, находящихся на стационарном лечении в БУЗ Омской области «ККВД» и103 донора БУЗ Омской области «Центр крови»в качестве группы контроля.Исследование клеток крови методом ДНК-комет проводилось в лаборатории кафедры клинической фармакологии ОмГМУ.
Критерии включения в основную группу (больных псориазом) сформулированы следующим образом: возраст старше 18 лет, добровольное согласие на участие в исследовании, заверенное личной подписью,диагноз «Псориаз вульгарный, прогрессирующая стадия (L40.0)», индексPASI более 10%.Критериями исключения были: пустулезный псориаз, псориатическая эритродермия, злокачественные новообразования и воздействие ионизирующей радиации в анамнезе, тяжелые заболевания печени и почек, хронические заболевания в стадию обострения, вирусные гепатиты, а также диагностические и лечебные процедуры с использованием рентгеновского и других видов облучения в течение четырех недель, прием алкоголя за двое суток до исследования. Образцы крови в основной группе взяты у 68 мужчин и 5 женщин в возрасте от 18 лет до 60 лет.
Отбор в группу сравнения (контрольную группу) осуществлялся согласно критериям включения: обследование согласно утвержденному порядку медицинского обследования донора крови и её компонентов [7], возраст от 18 до 60 лет, добровольное информированное согласие на участие в исследовании, заверенное личной подписью. Критериями исключения явились хронические заболевания в стадии обострения, применение лекарственных препаратов, диагностические и лечебные процедуры с использованием рентгеновского и других видов облучения в течение четырех недель, прием алкоголя за двое суток до исследования.В группе сравнения исследована кровь 55 мужчин и 48 женщин в возрасте от 18 лет до 60 лет.
Протокол исследования был одобрен локальным научным этическим комитетом ОмГМУ.
Кровь была получена посредством вакуумных систем в общем объеме 2 мл. Хранение и транспортировка крови осуществлялась в пробирках, покрытых раствором ЭДТА (К2) с использованием консерванта в соотношении 1:1. Консервант готовился extempore соединением растворовRPMI-1640 и ДМСО в соотношении 8:2. Хранение консервированной крови осуществлялось при температуре – 20оС, транспортировка – при 4оС. Проводили поэтапную обработку клеток крови: получение гель-слайдов с подложкой из агарозы и суспензии исследуемых клеток, помещение клеток в агарозный гель и нанесение на гель-слайды, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, фиксацию, окрашивание и микроскопический анализ [3]. Окрашивание люминесцентным красителем SIBR Green, анализ с помощью флюоресцентного микроскопа (ЛОМО, МИКМЕД 6, фильтр возбуждения, дихронное зеркало, запирающий фильтр, объектив 20Х). Сканирование и обработку ДНК-комет проводили при помощи программы САSP (рис.1).Нарисунке 1 представлены гель-слайды клеток крови: А – неповрежденные клетки (форма клетки не изменена), Б – поврежденные клетки (форма клетки изменена, имеется хвост кометы). И в этом хвосте находится фрагментированная ДНК, вышедшая из ядра клетки. При этом, чем больше процент содержания ДНК в хвосте кометы, тем выше уровень поврежденности ДНК клетки.
А
Б
Рис.1. Гель-слайды клеток крови: А – неповрежденные клетки, Б – поврежденные клетки
Статистическая обработка данных проводилась на основании современных методических подходов[8], с использованием пакета STATISTICA 6.1,MicrosoftOfficeExcel2007. Проверку нормальности распределения количественных параметров проводили с помощью критериев Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса и Шапиро-Уилка. Описание совокупности и разработка референтных интервалов уровня поврежденности ДНК мононуклеарных клеток крови проводилось методом персентилей,с использованием показателей медианы (Р50), верхних и нижних децилей (Р10 и Р90), квартилей (Р25 и Р75), минимума (Р0) и максимума (Р100).За верхнюю границу нормы изучаемого признака взят показатель Р75 в группе некурящих доноров. Для оценки связей применялся метод ранговой корреляции Спирмена с расчетом коэффициента корреляции rs и уровня статистической значимости р, а также визуализацией связи в целях ее проверки. Для сравнения количественных показателей двух независимых групп использован U-критерий Манна-Уитни, метод Фишера и χ2.В исследовании результаты считались значимыми при р< 0,05, значения уровня значимости приведены в виде р = 0,000….
Результаты исследования и их обсуждение
Болезнь. На рисунке 2 представлены результаты распределения уровня поврежденности ДНК мононуклеарных клеток крови в основной и контрольной группах. На рис 2А – количество наблюдаемых лиц в зависимости от уровня показателя,2Б – показатели распределения: медианы (Р50), квартилей (Р25 и Р75), минимума (Р0) и максимума (Р100).
А
Б
Рис. 2. Сравнительная характеристика показателей ДНК в хвосте кометы в группах больных и здоровых (U=2144,0; p=0,000): А – распределение наблюдаемых лиц в зависимости от уровня показателя, Б – показатели статистической нормы изучаемого признака (медианы Р50, квартилей Р25 и Р75), а также минимума (Р0) и максимума (Р100)
Как видно из рисунка 2, между группами больных псориазом и здоровых установлены статистически значимые различия по изучаемому показателю ДНК в хвосте кометы.
Во-первых, визуально распределение спонтанного уровня поврежденности ДНК в группе здоровых резко ассиметрично, с выраженной правой ветвью, что указывает на то, что большая часть здоровых людей имеет минимальный процент содержания ДНК в хвосте кометы клеток крови. Среди больных псориазом распределение признака приближается к нормальному, симметрично и уплощено, так что процент содержания ДНК в хвосте кометы в этой группе составляет от 1,9 до 24,3%, в то время как в группе здоровых – от 2,2 до 13,9% (рис. 2А и 2Б). В отношении определения нормы признака важно то, чтотреть здоровых людей имели минимальные показатели признака (от 2 до 4%) (рис. 2А). Однако же и часть больных, а именно 9 человек, имело такой же низкий уровень признака.
Во-вторых, отмечено статистически значимое превышение изучаемого показателя в группе больных по сравнению с контролем –9,2 и 5,4%[1] (U=2144,0; p=0,000).Подобное различие спонтанной фоновой поврежденности ДНК между здоровыми донорами и больными псориазом, возможно, указывает на генетическую природу заболевания, геномную нестабильность – селективный механизм, который позволяет клеткам приспособиться к изменившимся условиям существования с постепенной нормализацией своих функций или связано с прогрессирующей стадией данного заболевания, сопровождающейся повышением интенсивности процессов перекисного окисления липидов в плазме крови и избыточным образованием активных форм кислорода, обладающих генотоксическими и мутагенными свойствами.
Таким образом, можно утверждать, что этот метод информативен и для больных псориазом, результаты вполне приемлемы и объяснимы с точки зренияэтиопатогенеза и клиники псориаза [4].
Пол. Установлено отсутствие зависимости уровня изучаемого показателя от пола на примере контрольной группы. У мужчинпроцент ДНК в хвосте кометы составил от 2 до 14,3%, у женщин от 2 до 13%. В среднем по медиане у мужчин– 5,9, у женщин – 4,9% (при не существенных различиях).
Курение. При сравнении мужчин и женщин в контрольной группе по признаку «курение» статистически значимого различия не выявлено (χ2=0,18; р=0,67), то есть группы мужчин и женщин по признаку курения однородны и их можно сравнивать.
На рисунке 3приведеныхарактеристики распределения уровня поврежденности ДНК ядросодержащих клеток крови в контрольной группе среди курящих и некурящих лиц контрольной группы.
А
Б
Рис. 3. Сравнительная характеристика показателей ДНК в хвосте кометы среди курящих и некурящих в группе здоровых доноров: А – количество наблюдаемых лиц в зависимости от уровня показателя (U=784,0; p=0,024), Б – показатели распределения: медианы (Р50), квартилей (Р25 и Р75), минимума (Р0) и максимума (Р100)
В контрольной группе установлено статистически значимое превышение показателя спонтанного уровня поврежденности ДНК в ядросодержащих клетках крови курящих по сравнению с некурящими –7,5 и 5,0%, соответственно (U=784,0; p=0,024). Большая часть исследуемого контингента имеют уровень признака в диапазоне от 3 до 4 (рис. 3).
В группе больных псориазом не установлено статистически значимого различия изучаемого признака по признаку курения: у курящих среднее значение по медиане составило 9,6%, у некурящих – 8,7%.
То есть, получены противоречивые результаты зависимости исследуемого признака от курения у больных и здоровых.
Референтныйинтервалуровня поврежденности ДНК в ядросодержащих клетках крови.На рисунке 4 представлены показатели распределения изучаемого признака в контрольной группе, с разделением курящих и некурящих (поскольку отмечены статистически значимые различия).
Рис. 4. Показатели распределения поврежденности ДНК в ядросодержащих клетках крови курящих и некурящих лиц контрольной группы
При решении задачи разработки границ референтного интервала уровня поврежденности ДНК в ядросодержащих клетках крови было принято положение о том, что о патологии свидетельствует увеличение признака, а не уменьшение. Поэтому нижней границей референтного интервала изучаемого признака принят 0,0 (минимальное значение показателя или Р0), а в качестве верхней границы – значениетретьего квартильного интервала Р75, причем для некурящих. Таким образом, возможный уровень поврежденности ДНК у здоровых лиц варьирует в пределах от 0 до 7,8% (Р0– Р75) .
Возраст. Отмечено отсутствие зависимости уровня поврежденности ДНК мононуклеарных клеток крови от возраста как в основной (rs = -0,061, р = 0,616), так и контрольной группах (rs= -0,094, р = 0,345) (рис. 5). Как видно из рисунка 5, минимальный уровень показателя – около 2,0% – имели пациенты в возрасте31, 34, 39 и 58 лет, а максимальный уровень признака – более 18%- отмечен у пациентов в возрасте от 29 до 46 лет. Стрелочками отмечены пациенты, имевшие минимальный уровень поврежденности ДНК ядросодержащих клеток крови, а в овале, очерченным черной сплошной линией представлены больные с максимальными показателями.
Рис.5. Зависимость уровня поврежденности ДНК мононуклеарных клеток крови от возраста у больных псориазом
Установленный фактсогласуется с данными литературы (Арутюнян Р. М, Оганесян Г.Г, Нерсесян А. К., 2001).
Интерпретируя полученные результаты, можно сделать вывод, что в группе больных псориазом уровень поврежденности ДНК клеток крови не зависел от возраста и наличия вредной привычки курение, а в контрольной группе – степень поврежденности ДНК у курящих была выше, а от возраста и пола не зависела.
Различия уровня поврежденности ДНК ядросодержащих клеток крови среди мужчин и женщин в основной группе будут опубликованы позднее.
Выводы:
1. Результаты нашего исследования показали, что фоновая поврежденность ДНК периферических мононуклеарных клеток крови у больных псориазом по сравнению с контрольной группой выше: соответственно, 9,2 и 5,4% по медиане (U=2144,0; p=0,000).
2. В контрольной группе отмечены статистически значимое превышение степени поврежденности ДНК в группе курильщиков по сравнению с некурящими: 7,5 и 5,0% по медиане (U=784,0; p=0,024). У больных псориазом такой зависимости не установлено: у больных курильщиков степени поврежденности ДНК составляет 9,6%, а у некурящих больных – 8,65% (U=588,0; p=0,783).
3. Не установлено зависимости фонового уровня поврежденности ДНК ядросодержащих клеток крови от возраста ни в основной, ни в контрольных группах. В контрольной группе не отмечено существенных различий изучаемого признака у мужчин и женщин.
4. Предложены границы референтного интервала уровня поврежденности ДНК ядросодержащих клеток крови – от 0 до 7,8%. Интервал рассчитан по данным некурящих здоровых лиц.
5. Метод ДНК-комет является чувствительным методом для определения спонтанного или индуцированного уровня поврежденности ДНК клеток крови больных псориазом и может быть использован в дальнейших исследованиях в направлении изучениягенотоксичностииммуносупрессивныхметодов терапии псориаза.
Коллектив авторов выражает признательностьруководству и сотрудникам БУЗ ОО «ККВД»иБУЗ ОО «Центр крови» за помощь в наборе клинического материала.
Рецензенты:Матусевич С.Л., д.м.н., доцент кафедры, заведующий кафедрой кожных и венерических болезней с курсом косметологии ГБОУ ВПО «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г.Тюмень;
Немчанинова О.Б., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой дерматовенерологии и косметологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г.Новосибирск.
[1]среднее значение по медиане