Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

ANALYSIS OF EGFR GENE MUTATION STATUS IN LUNG CANCER PATIENTS

Kit O.I. 1 Vodolazhskiy D.I. 1 Lazutin Yu.N. 1 Oleynikova E.N. 1 Dvadnenko K.V. 1 Enin Ya.S. 1 Oleynikov D.D. 1 Pyltsin S.P. 1 Chubaryan A.V. 1
1 Rostov Research Institute of Oncology
Рак легкого занимает одно из ведущих мест по показателю смертности среди онкологических заболеваний. Понимание факторов, участвующих в этиологии рака легкого, требуется для прогнозирования потенциальных групп риска, которые могут иметь клиническое значение для разработки оптимальных схем лечения. Проведен анализ частот встречаемости 29 соматических мутаций в гене EGFR методом RT-PCR у 435 пациентов Юга России с диагнозом «аденокарцинома легкого». Учитывались гендерная принадлежность и статус курения у пациентов. Полученные данные свидетельствуют о важной роли не только статуса курения, но и гендерной принадлежности в возникновении соматических мутаций в гене EGFR. В группе некурящих мужчин частота встречаемости мутаций в гене EGFR была в 19 раз больше, чем в группе курящих мужчин; в группе некурящих женщин – в 2 раза больше, чем в группе курящих женщин; в группе некурящих мужчин – в 2,2 раза меньше, чем в группе некурящих женщин. Частота встречаемости мутантного типа гена EGFR у курящих мужчин была почти в 23 раза меньше, чем в группе курящих женщин. Можно предположить, что частота встречаемости соматических мутаций в гене EGFR положительно регулируется женскими половыми гормонами.
Lung cancer mortality rate is one of the highest among cancer death rates. Understanding of the factors involved in the etiology of lung cancer is necessary to predict the potential risk groups which may be clinicallysignificantfor the development of optimal treatment regimens. The frequency of 29 somatic mutations in the EGFR gene was analyzed by RT-PCR in 435 patients inthe South of Russia diagnosed with adenocarcinoma of the lung.Gender and smoking status of the patients were taken into account. The resultsdemonstratethat not only the smoking status but the gender as well is important in the occurrence of somatic mutations in the EGFR gene. The frequency of EGFR mutations in the group of non-smoking menwas 19 times higher than in the group of male smokers; in the group of non-smoking women–twice as high as in the group of women smokers; in the group of non-smoking men - 2.2 times lower than in the group of non-smoking women. The frequency of mutant EGFR gene detection in male smokers wasalmost 23 times lower than in the group of female smokers. We can suppose that the frequency of somatic mutations in the EGFR gene is positively regulated by female sex hormones.
smoking status.
patient gender
mutations in the EGFR gene
adenocarcinoma of the lung

Рак легкого (РЛ) занимает одно из ведущих причин смертности среди онкологических заболеваний во многих странах мира. Понимание факторов, участвующих в этиологии рака легкого требуется для прогнозирования потенциальных групп риска, которые могут иметь существенное клиническое значение для разработки оптимальных схем лечения этого заболевания[1]. Острота проблемы обусловлена не только высокой распространенностью этого заболевания, но и его традиционно поздней диагностикой [3].

В 2012 году во всем мире было зарегистрировано 1 825 000 новых случаев заболеваний РЛ.Из них -приблизительно 68% среди мужчин и32% - среди женщин. При этом общий показатель смертности составил 1 590 000 случаев (1 099 000 - среди мужчин, 491 000 - среди женщин) или почти 90%[5].Показатель распространенности заболеваемости РЛ в России в 2014 г. составил 90,6 на 100 000 населения с тенденцией к повышению, что обусловлено как ростом заболеваемости и выявляемости, так и с увеличением выживаемости онкологических больных [6].

Курение является на сегодняшний день основным источником рака легких. Сигаретный дым содержит по меньшей мере 73 известных канцерогена, в том числе бенза-пирен, нитрозамины (NNK), 1,3-бутадиен и α-радиоактивный изотоп полония, полоний-210. В мире 85-95% случаев РЛ этиологически связаны с курением у мужчин и 65-80 % РЛ -у женщин [9]. По данным отчета ВОЗ за 2011 г. распространенность РЛ среди курящих женщин составляет 38, а среди курящих мужчин - 125 на 100 тысяч населения, тогда как среди некурящих этот показатель равен 7 на 100 тысяч человек [10].

Открытие соматических мутаций в генеEGFR явилось ключевым моментом в разработке таргетного подхода лечения немелкоклеточного рака легкого и привело к необходимости скринингачувствительности/устойчивости клеток опухолей легкого к ингибиторам тирозинкиназ с использованием молекулярно-генетическихметодов[8]. Мутации в гене EGFR чаще обнаруживаются в аденокарциномах легкого у некурящих женщин. Однако мутации гена EGFR также могут обнаруживаться в других подгруппах пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC), в том числе у бывших или настоящих курильщиков [2].

При сравнении пациентов с диким типом генаEGFR,пациенты с мутантным геном, получающие терапию ингибиторами тирозинкиназ, имеют более продолжительный период выживаемости, чем получающие химиотерапию. Медиана периода выживаемости у пациентов с метастатическим раком легкого с мутантным вариантом генаEGFR, получавшим лечение ингибиторами EGFR первого и второго поколения, составляет около 2-х лет [7].

ЮФО в совокупности с Северным Кавказом представляет собой уникальный регион с оседлым проживанием различных этносов. В связи с этим данное исследование может служить моделью для скрининга проявления частот мутаций в гене EGFR, что крайне важно для прогнозирования стандартов лечения и планирования скрининговых программ при использовании таргетных препаратов. Поэтому целью настоящего исследования являлось изучение закономерностей в частотах встречаемости 29 соматических мутаций в генеEGFRтканей опухолей пациентов Юга России с диагнозом «аденокарцинома легкого» и выявление ассоциаций обнаруженных мутацийс гендерной принадлежностьюи статусом курения.

Материалы и методы

В данное исследование были включены 435 пациентов с подтвержденным диагнозом «аденокарцинома легкого», получавших стационарное лечение в ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ. Проведен анализ в частотах проявления мутаций в гене EGFR с учетом гендерных особенностей и статуса курения.Мужчины - 278 человек (64%) из них: 105(37,7%) никогда не курили и 173(62,2%) курили.Женщины - всего 157 человек (36%) из которых никогда не курили - 145(92,3%), а курили - 12 (7,6%).

Для молекулярно-генетических исследований использовались FFPE блоки, фиксированные в 10% забуференном формалине, содержащие не менее 20% опухолевой ткани, из которых получали срезы толщиной 3 мкм. Экстракция ДНК проводилась после стандартной процедуры двойной депарафинизации срезов орто-ксилолом и спиртом, с использованием набора QIAamp® DNAFFPETissueKit (QIAGENE, Германия) согласно протоколу производителя. Концентрацию полученной ДНК из образцов измеряли на флюориметреQubit 2.0® с использованием набора Quant-iTTMdsDNAHigh-Sensitivity (HS) AssayKit (Invitrogen, США).Детекцию 29 соматических мутаций в гене EGFR проводили с помощью набора реагентов «TherescreenEGFRRGQPCRKit» (QIAGENE, Германия) с использованием термоциклераRotor-GeneQ (QIAGENE, Германия).

Статистический анализ проводили с использованием программ Microsoft Excel 2013 и STATISTICA 7.Оценивали достоверность различий с использованием непараметрического критерия χ2, для общепринятого уровня статистической значимости р<0,05. Определяли различия в проявлении частот мутантного и дикого типов гена EGFR в группах пациентов,сгруппированныхна основании ихгендерной принадлежности и статуса курения.

Результаты и обсуждение

Согласно полученным в нашем исследовании данным, средняя частота встречаемости мутантного типа гена EGFR среди всех пациентов Юга России составила 25,7% (табл. 1).

Таблица1

Частоты встречаемости мутантного типа генаEGFR у мужчин и женщин

Пол

Общее число пациентов,

n= 435(100%)

Статус гена EGFR

Значение критерия χ2

Значение p, статистическая значимость р<0,05

Дикий тип,

n= 323 (74,2%)

Мутантный тип,

n=

112(25,7%)

Пол

Мужчины

278 (64%)

236(84,9%)

42(15,1%)

45.60

0,0000

значимо

Женщины

157(36%)

87(55,4%)

70(44,5%)

При анализе частоты встречаемости мутантного типа гена EGFR среди пациентов с учетом гендерного признака (без учёта статуса курения) замечено,что у пациентов мужского пола этот показатель cоставил 15,1%, что было в 3 раза меньше аналогичного показателя в группе пациентов женского пола - 44,5%. (χ2=45.60 р=0,0000). Полученные различия являются статистически достоверными для уровня значимости p<0.05. (Таблица 1).

На следующем этапе нашего исследованиячастоты встречаемости мутантного типа гена EGFR у пациентов с диагнозом «аденокарцинома легкого» были проанализированы с учётом статусакурения, но без учета гендерных различий (табл. 2).

Таблица 2

Частоты встречаемости мутантного типа гена EGFRв зависимости от статуса курения

Статус курения

Общее число пациентов,

n= 435(100%)

Статус гена EGFR

Значение критерия χ2

Значение p, статистическая значимость р<0,05

Дикий тип,

n= 323 (74,2%)

Мутантный тип,

n=

112(25,7%)

Статус курения

Никогда не курил

250(57,4%)

161(64,4%)

89 (35,6%)

29,85

0,0000

значимо

Курил

185(42,5%)

162(87,5%)

23 (12,4%)

В группе не курящих пациентов Юга России частота встречаемости мутантного типа в гене EGFRсоставила  -35,6%, что почти в 3 раза больше, чем в группе курящих пациентов - 12,4% (χ2 =29,85; р= 0,0000). В рамках нашего исследования отличия мутантного типа в гене EGFR в группе курящих и не курящих пациентов независимо от пола являются статистически достоверными для уровня значимостир<0,05.Далее каждая гендерная группа была дополнительно проанализирована с учётом статуса курения пациентов. Группа пациентов мужского пола была разделена на курящих и тех, кто никогда не курил (табл.3).

Таблица 3

Частоты встречаемости мутантного типа гена EGFRу мужчин в зависимости от статуса курения

Статус курения

Общее число пациентов,

n= 278(100%)

 

Статус гена EGFR

Значение критерия χ2

Значение p, статистическая значимость р<0,05

Дикий тип,

n= 236(84,9%)

Мутантный тип,

n=42(15,1%)

Мужчины

Никогда не курил

105 (37,7%)

83 (79%)

22 (21%)

4,49

0,0340

значимо

Курил

173(62,2%)

153(88,4%)

20(1,1%)

В группе никогда не куривших мужчин частота встречаемости мутантного типа гена EGFR составила 21%, что в 19 раз превышало аналогичный показатель для группы курящих мужчин - 1,1%. Данные различия были статистически достоверны (χ2=4,49 р=0,0340) для уровня значимости р<0,05.

Группа пациентов женского пола была также разделена на куривших и никогда не куривших пациентов (Табл. 4).

Таблица 4

Частоты встречаемости мутантного типа гена EGFRу женщин в зависимости от статуса курения

Статус курения

Общее число пациентов,

n= 157(100%)

 

Статус гена EGFR

Значение критерия χ2

Значение p, статистическая значимость р<0,05

Дикий тип,

n= 87(55,4%)

Мутантный тип,n=70(44,5%)

Женщины

Никогда не курила

145(92,3%)

78(53,8%)

67 (46,2%)

2,02

0,1555

не значимо

Курила

12(7,6%)

9(75%)

3 (25%)

Частота проявления мутантного типа генаEGFRу женщин, которые никогда не курили, составила 46,2%, что почти в 2 раза выше по сравнению с аналогичной группой курящих женщин - 25% (χ2=2,02 р=0,1555), что соответствует даннымдругих исследований[4]. Однако полученные нами различия носили характер тенденции и не были статистически достоверными для уровня значимости р<0,05 в силу недостаточности анализируемых событий (всего 12 куривших женщин из 157 пациенток женского пола или 7,6%).

Также нами были проанализированы частоты встречаемости мутантного типа гена EGFR в зависимостиот статуса куренияигендерной принадлежности пациентов (Табл.5).

Таблица 5

Частоты встречаемости мутантного типа гена EGFRв зависимости от статуса курения в различных гендерных группах

Характеристика

 

Общее число пациентов,

n= 157(100%)

Статус гена EGFR

Значение критерия χ2

Значение p, статистическая значимость р<0,05

Дикий тип,

n= 87(55,4%)

Мутантный тип,

n=70(44,5%)

Не курят

Мужчины

105 (37,7%)

83 (79%)

22 (21%)

16,94

0,0000

значимо

Женщины

145(92,3%)

78(53,8%)

67(46,2%)

Курят

Мужчины

173(62,2%)

153(88,4%)

20(1,1%)

1,86

0,1724

не значимо

Женщины

12(7,6%)

9(75%)

3(25%)

Частота проявления мутантного типа гена EGFR у не курящих мужчин составила 21%, что в 2,2 раза меньше, чем в аналогичной группе женщин - 46,2% (χ2=16,94 р=0,0000). При этом у курящих мужчин частота встречаемости мутантного типа гена EGFRсоставила 1,1%, что почти в 23 раза меньше по сравнению с группой курящих женщин - 25% (χ2=1,86 р=0,1724). Однако такие большие различия носили характер тенденции, так как не были статистически достоверны для общепринятого уровня значимости (p<0.05). Мы объясняем это особенностью расчета критерия χ2, который требует наличия определенного количества зарегистрированных событий. В данном случае малочисленной оказалась группа курящих женщин (Таблица 5).

Заключение

Полученные в рамках данного исследования данные подтверждают высокую значимость статуса курения для частоты проявления мутаций в гене EGFR: частота проявляемости мутаций в гене EGFRу пациентов Юга России была существенно выше в группе не курящих пациентов. Нами выявлены статистически достоверные различия в частотах проявления мутаций в генеEGFRв различных гендерных группах пациентов Юга России с учетом статуса курения. Частота мутаций в гене EGFR (без учета статуса курения) среди мужчин составила 15,1%, что было в 3 раза меньше, чем частота встречаемости мутантного типа гена EGFR среди женщин - 44,5%. В ходе исследования выявлено, что частота мутаций в гене EGFRв группе мужчин, которые никогда не курили (21%), была в 19 раз больше, чем в аналогичной группе курящих мужчин (1,1%). Частота встречаемости мутантного типа генаEGFR в группе не курящих женщин была равна 46,2%, что практически в 2 раза больше, чем в аналогичной группе курящих женщин - 25%. В группе не курящих мужчин частота встречаемости мутантного типа гена EGFR составила 21%, что в 2,2 раза меньше, чем в группе не курящих женщин - 46,2%. При этом частота встречаемости мутантного типа гена EGFRу курящих мужчин в нашем исследовании составила величину 1,1%, что почти в 23 раза меньше, чем в группе курящих женщин - 25%.

Таким образом, значимым фактором в возникновении SNP - мутаций в гене EGFR является не только статус курения, но и гендерная принадлежность пациента. Это позволяет нам предположить, что возникновение соматических мутаций в гене EGFR усиливается женскими половыми гормонами.

Рецензенты:

Франциянц Е.М., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону;

Горошинская И.А., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону.