Одним из сильнейших канцерогенов и мутагенов является радон, к воздействию которого наиболее чувствительны дети и подростки. Кафедрой генетики КемГУ в ходе экспедиционных выездов 2007–2011 годов была выявлена повышенная удельная объемная активность радона в воздухе жилых и учебных помещений школы-интерната г. Таштагол Кемеровской области [3]. Проведенные исследования частоты и спектра хромосомных аберраций (ХА) в лимфоцитах периферической крови подтвердили наличие кластогенных эффектов воздействия повышенных доз радона [3].
В процессах адаптации индивидов к неблагоприятным экологическим условиям важную роль могут играть рибосомные гены, которые контролируют весь биосинтез белка в клетке. В ряде исследований изучалась роль рибосомных генов в процессах адаптации индивидов к неблагоприятным экологическим условиям. Было показано, что появление большого числа хромосом с крупными вариантами Ag-ЯОР можно объяснить компенсаторной активацией резервных копий генов рРНК, имеющихся в отдельных ЯОР, которая подразумевает приспособительное включение адаптивных механизмов и может служить важным фактором поддержания внутриклеточного гомеостаза при стрессовых воздействиях [4].
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы является изучение взаимосвязи дозы активных копий рибосомных генов (АкРГ) на уровень ХА у детей и подростков, подвергающихся воздействию радона.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили препараты лимфоцитов периферической крови 272 детей и подростков, из них 139 мальчиков (средний возраст 12,73 ±0,23 лет) и 133 девочки (средний возраст 13,05 ±0,23 лет), постоянно проживающих и обучающихся в школе-интернате г. Таштагол. В группу сравнения вошло 185 детей и подростков, проживающих в сельских населенных пунктах с отсутствием выраженного загрязнения окружающей среды по радиационным и химическим показателям: с. Красное, с. Пача и с. Зарубино. Средний возраст детей и подростков из группы сравнения составил 13,90 ± 0,28 лет у мальчиков (83 человека), у девочек 14,84 ± 0,25 года (102 человека). Учитывали четыре основные категории хромосомных аберраций: хроматидные и хромосомные разрывы (фрагменты); хроматидные и хромосомные обмены.
Активность рибосомных генов оценивали на препаратах хромосом, окрашенных нитратом серебра по методу Howell&Black (1980) с модификациями. Размеры AgЯОР выражали в условных единицах, оценивая их визуально по 5-балльной системе: 0 баллов – окраска отсутствует, 1 – окраска слабая (зерно серебра меньше ширины хроматиды), 2 – средняя окраска (зерно серебра примерно соответствует ширине хроматиды), 3 – интенсивная окраска (зерно серебра больше ширины хроматиды), 4 – зерно серебра намного больше ширины хроматиды. Определяли суммарный показатель всех 10 AgЯОР, для каждого человека анализировали активность ядрышкообразующих районов хромосом в 20 клетках.
Статистический анализ первичных данных осуществляли средствами STATISTICA for WINDOWS v.8.0 и MS Excel 2007. Для исследования использовали методы непараметрической статистики (U-критерий Манна – Уитни для сравнения групп). Статистически значимыми считали различия при p<0.05. Для анализа взаимосвязи дозы активных рибосомных генов с уровнем хромосомных нарушений использовали методы логистической регрессии. Для построения регрессионной модели оценивали пороговый уровень ХА, который позволяет отличать обследованных в когорте, экспонированной радоном, от детей и подростков из группы сравнения. Для вычисления порогового значения уровня ХА проводили анализ ROC-кривых с помощью программы MS Excel 2007. Для минимизации статистической ошибки первого типа вводили поправку на множественность сравнений (поправка Бонферрони).
Результаты
В результате замеров удельной объемной активности радона в жилых и учебных помещениях школы-интерната г. Ташатагол и с. Красное, Пача и Зарубино ранее было выявлено статистически значимое превышение данного показателя в воздухе помещений школы-интерната г. Таштагол, в среднем уровень составил 479,71 Бк\м3, достигая 1400 Бк/м3 в зимние периоды. В контрольных населенных пунктах все радиологические показатели не превышали нормативных значений.
Исследование частоты и спектра хромосомных нарушений у детей-воспитанников школы-интерната г. Таштагол демонстрирует существование выраженного генотоксического воздействия факторов окружающей среды (табл.1).
Таблица 1
Хромосомные аберрации в группе детей и подростков, проживающих в г. Таштагол и контрольной группе
|
Группа |
Доля аберрантных метафаз, % |
Число аберраций на 100 клеток |
|||
|
фрагменты |
обмены |
||||
|
одиночные |
парные |
хроматидные |
хромосомные |
||
|
Дети г. Таштагол |
4,68 ± 0,15* |
3,36 ± 0,13* |
1,22 ± 0,06* |
0,025 ± 0,008 |
0,21 ± 0,03** |
|
Группа сравнения |
2,69 ± 0,11 |
2,02 ± 0,09 |
0,63 ± 0,05 |
0,030 ± 0,009 |
0,06 ± 0,013 |
Примечание: *p < 0,001; достоверно отличается от значений для группы сравнения; **p < 0,01, достоверно отличается от значений для группы сравнения.
Основной цитогенетический показатель – доля аберрантных метафаз в когорте обследованных из г. Таштагол статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой (p < 0.001). Особое внимание обращает на себя высокая частота встречаемости в опытной группе обменов хромосомного типа, так как именно аберрации данного типа являются хорошим маркером воздействия радиации [2].
В результате анализа дозы АкРГ было выявлено, что среднее значение в исследуемой группе (г. Таштагол) составляет 18,59±0,10 баллов, что согласуется с результатами, полученными раннее, для различных возрастных групп Кемеровской области, не подвергавшихся генотоксическим воздействиям [6]. Статистически значимых отличий дозы активных рибосомных генов в зависимости от возрастной и половой принадлежности не выявлено.
С целью выявления взаимосвязи уровня ХА и дозы транскрибируемых рибосомных генов всю выборку детей, подвергающихся воздействию сверхнормативных доз радона, разделили на группы в зависимости от дозы АкРГ. Группы были сформированы исходя из результатов процентильного анализа:
· с низкой дозой АкРГ (33,33 процентиль), в которую вошли дети и подростки, у которых данный показатель не превышал 18,00 баллов (53 человека);
· со средней дозой активных рибосомных генов (53 человека) – вошли дети и подростки, у которых значение дозы АкРГ было выше 18,00 баллов, но ниже 19,12;
· с высокой дозой АкРГ (66,66 процентиль) – вошли обследуемые, у которых данный показатель превысил 19,12 баллов (54 человека).
При проведении сравнительного анализа дозы АкРГ и уровня хромосомных аберраций было выявлено статистически значимое увеличение частоты встречаемости хромосомных нарушений у обследуемых со средней дозой, по сравнению с детьми и подростками с низкой и высокой дозой транскрибируемых рибосомных генов (рис. 1).
Рис.1. Частота хромосомных аберраций у детей и подростков с различной дозой активных рибосомных генов
Примечание: *p<0,01, отличие обследованных со средней дозой АкРГ от детей с высокой дозой и низкой дозой; **p<0,01 отличие обследованных со средней дозой АкРГ от детей с высокой дозой и низкой дозой; #p<0,02, отличие обследованных со средней дозой АкРГ от детей с высокой дозой и низкой дозой; ## p<0,02, отличие обследованных со средней дозой АкРГ от детей с высокой дозой
На следующем этапе исследования группа детей и подростков из г. Таштагол была разделена на две группы в зависимости от уровня ХА. В результате ROC-анализа было выявлено пороговое значение уровня ХА, равное 3,5 %. Группа с низким уровнем хромосомных нарушений была сформирована из детей и подростков, у которых частота встречаемости хромосомных аберраций меньше 3,5 %, остальные образовали группу с высоким уровнем ХА.
В ходе исследования было выявлено увеличение частоты встречаемости средней дозы транскрибируемых рибосомных генов в группе лиц с высоким уровнем цитогенетических нарушений (43,56 %) по сравнению с детьми и подростками с низкой частотой встречаемости ХА (26,53 %). Логистический регрессионный анализ выявил наличие положительной ассоциации средней дозы АкРГ с увеличением частоты встречаемости хромосомных нарушений (OR= 2,14;0,52 – 8,77; χ2=4,91; p=0,027).
Таким образом, полученные результаты указывают на существование взаимосвязи средней дозы транскрибируемых рибосомных генов и высокого уровня ХА в условиях воздействия повышенных доз излучения радона.
Обсуждение
Полученные в данном исследовании значения уровня хромосомных аберраций у детей из школы-интерната г. Таштагол, проживающих в условиях воздействия повышенных доз радона, статистически значимо превышают частоту цитогенетических нарушений у их сверстников из группы сравнения. Эти результаты согласуются с данными, полученными в более ранних исследованиях, проводимых в г. Таштагол [3]. Подобные кластогенные эффекты у детей, экспонированных радоном в условиях проживания и обучения в образовательном учреждении интернатного типа, ранее наблюдали исследователи из Словении [8].
Имеются данные о том, что рибосомные гены могут играть роль в процессах адаптации индивидов к неблагоприятным экологическим условиям, например, при воздействии угольной пыли было выявлено увеличение уровня хромосомной нестабильности у лиц с более низкой дозой АкРГ [7]. В другом исследовании, было показано увеличение дозы активных рибосомных генов у рабочих коксохимического производства со стажем свыше 14 лет [6].
Доза АкРГ человека в условиях воздействия повышенного излучения от радона ранее изучена не была. В результате обследования детей г. Таштагол было выявлено, что у носителей средней дозы АкРГ наблюдался самый высокий уровень ХА по сравнению с низкой и высокой дозами. Результаты нашего исследования согласуются с данными, полученными в Курской области, где было показано увеличение частоты встречаемости ХА у лиц со средней дозой АкРГ в условиях спонтанного мутагенеза [1], но остается неясным вопрос о причинах снижения уровня цитогенетических нарушений у носителей низкой дозы транскрибируемых рибосомных генов. Возможно, данное явление связано с увеличением гибели клеток с поврежденной ДНК. В пользу этого говорят результаты исследования in vitro, проведенного на фибробластах кожи при воздействии хромата калия, где наблюдалось увеличение количественных показателей гибели клеток с низкой дозой АкРГ в геноме [5]. Самая низкая частота встречаемости хромосомных поломок была обнаружена у носителей высокой дозы рибосомных генов, что может быть связано с высокой пролиферативной активностью лимфоцитов в клеточной культуре, ведущей к элиминации клеток с ХА, и более интенсивным синтезом ферментов репарации. Несомненно, данные предположения нуждаются в дальнейшей экспериментальной проверке. Тем не менее полученные результаты могут быть использованы при разработке системы прогноза индивидуальной радиочувствительности.
Исследование проведено при финансовой поддержке гранта РФФИ №13-06-98014 р-Сибирь-а и государственного задания Минобрнауки РФ № 2015/ 2162.
Рецензенты:
Дружинин В.Г., д.б.н., профессор, проректор по научной работе ФГБУН «Кемеровский государственный университет», г. Кемерово;
Лавряшина М.Б., д.б.н., доцент, профессор кафедры генетики Кемеровского государственного университета, г. Кемерово.