Цель. Выявить цито-иммунологические особенности индуцированной мокроты у детей, перенесших острый обструктивный бронхит, и с впервые выявленной бронхиальной астмой.
Материалы и методы исследования
Исследование проведено по типу поперечного среза. Метод выборки - сплошной (по мере поступления в стационар). Источниковая популяция - пациенты, поступившие на обследование в отделение патологии детей раннего возраста и детское аллергологическое отделение МУЗ ГКБ № 1 г. Челябинска за период 2005-2006 гг. Критерии включения для всех детей: возраст до 5 лет, отсутствие в течение предшествовавшего месяца эпизодов острых инфекционно-воспалительных заболеваний, вакцинации, согласие родителей на участие в исследовании. Дети были разделены на три группы: с острым обструктивным бронхитом (ООБ) в анамнезе (группа 1, n=75), с впервые выявленной БА (группа 2, n=21), дети без аллергических заболеваний и эпизодов ООБ в анамнезе (группа 3 - сравнения, n=17). На всех детей была заполнена разработанная нами персональная анкета. Проводилось исследование: общий анализ крови (ОАК), общий IgE крови, исследование клеточного состава назального секрета (НС), клеточного состава и иммунологических показателей индуцированной мокроты (ИМ). Для исследования использовали мокроту, собранную у детей натощак, после ингаляции 5 % хлорида натрия [4]. В ИМ определяли следующие показатели: количество белка (Кочетов Г. А., 1980); уровни sIgA, IgМ, IgG, субклассов IgG1-IgG4, IFN-γ, IL-4, IL-8, IL-13, TNF-α определяли методом ИФА (тест-системы ЗАО «Вектор-Бэст», г. Новосибирск). Статистический анализ данных проводился при помощи пакетов статистических программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, 2001) и SPSS 12.0. При распределении признака в выборке близком к нормальному, количественные значения представлялись в виде средней арифметической и её среднеквадратичного отклонения (M±σ). При непараметрическом распределении признака рассчитывались медиана и интерквартильный размах (Ме; 25-75 %). Для оценки различий между двумя группами в количественных признаках при распределении, близком к нормальному, применяли t-критерий Стьюдента, в остальных случаях - непараметрический U-тест Манна-Уитни. Оценка межгрупповых различий по качественным признакам проводилась с использованием критерия χ2 (хи-квадрат) и точного критерия Фишера. При проведении корреляционного анализа использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для всех видов анализа статистически достоверными считались значения p<0,05.
Результаты и обсуждение
Возраст обследованных детей составил от 9 месяцев до 5 лет, средний возраст -3,3±1,4 лет. Все группы были сопоставимы по возрасту и полу.
При изучении содержания эозинофилов периферической крови (%), выявлено их повышение относительно группы сравнения только в группе БА, что подтверждают и данные литературы [9, 11], причем в этой группе частота повышенного уровня эозинофилов (≥5 %) в 2,5 раза выше, чем в остальных (р<0,05) (таблица 1).
Таблица 1
Лабораторные показатели обследованных детей, Ме; 25-75 %
Показатели |
Группа 1 ООБ n=75 |
Группа 2 БА n=21 |
Группа 3 группа сравнения n=17 |
Эозинофилы в ОАК, % |
2,0 1,0-4,0 |
6,0*, ** 2,5-8,5 |
1,5 1,0-3,0 |
IgE крови общий, МЕ/мл |
55,7 16,8-143,5 |
126,2* 41,0-209,5 |
36,0 23,8-68,5 |
Эозинофилы НС, % |
10,0* 2,0-25,0 |
31,0* 6,5-58,5 |
0 0-0,5 |
Примечание. Значимость различий (р<0,05): * - с группой сравнения; ** - между группами 1 и 2. |
Уровень общего IgE крови также оказался выше в группе БА; в группе ООБ данный показатель был в 1,5 раза выше, чем у детей без аллергических заболеваний. При анализе распространенности повышенного уровня IgE (≥100 МЕ/мл) в группах были выявлено, что при БА частота составила 52,3 %, ООБ - 34,7 %, при отсутствии таких детей в группе сравнения (P1-3<0,05; Р2-3<0,05; P1-2<0,05). Следует отметить, что хотя повышенные уровни эозинофилов ОАК и общего IgE крови являются маркерами атопии/аллергии, эти показатели не являются чувствительным и специфичным в диагностике БА [9, 11].
По результатам нашего исследования показано высокое содержание эозинофилов в НС в группах БА и ООБ, причем 81 % детей с БА и 57,3 % детей с ООБ даже при отсутствии жалоб имели на момент осмотра лабораторные проявления аллергического ринита (АР) (содержание эозинофилов в НС <5 %), при отсутствии таких детей в группе сравнения (P1-3<0,05; Р2-3<0,05; P1-2<0,05). По данным отечественных и зарубежных исследователей АР является независимым фактором риска развития БА, его распространенность при БА составляет 70-90 %, в свою очередь у 38 % детей с АР диагностируется БА [7, 9, 11].
Одним из перспективных неинвазивных методов оценки изменений слизистой оболочки бронхов при БА является подсчёт эозинофилов в мокроте, повышенное содержание которых является биологическим маркером БА [11, 13]; помимо цитологического, возможно исследование цитокинового профиля ИМ. Анализ клеточного состава ИМ у больных требует знания количества клеток и их соотношения у здоровых людей. В настоящее время не существует унифицированных табличных цитограмм для здоровых детей разных возрастных групп. Многие исследователи за повышенный уровень эозинофилов в ИМ у детей берут значение равное 2,5 % и более [7, 12], в данной работе за повышенный уровень принят показатель ≥2,5 %. Данные, характеризующие клеточный состав ИМ обследованных детей, представлены в таблице 2.
Таблица 2
Клеточный состав индуцированной мокроты обследованных детей, Me; 25-75 %
Показатели |
Группа 1 ООБ n=75 |
Группа 2 БА n=21 |
Группа 3 группа сравнения n=17 |
Эозинофилы |
2,0* 0-7,0 |
17,0*, ** 7,5-52,5 |
0 0-0,4 |
Нейтрофилы |
67,0 50,0-81,0 |
47,0 17,0-76,0 |
63,0 43,0-80,5 |
Макрофаги |
19,0 9,0-35,0 |
15,0 10,0-30,0 |
30,0 12,0-49,5 |
Лимфоциты |
5,0 3,0-8,0 |
4,0 2,0-7,5 |
4,0 2,5-8,25 |
Примечание. Значимость различий (р<0,05): * - с группой сравнения; ** - между группами 1 и 2. |
Наиболее высокий уровень эозинофилов в ИМ выявлен в группе БА (Р2-3<0,05; P1-2<0,05), но и в группе ООБ этот показатель оказался в несколько раз выше, чем в группе сравнения (P1-3<0,05), что не противоречит данным российских и зарубежных авторов [2, 7, 12, 13]. Распространенность повышенного уровня эозинофилов в ИМ (≥2,5 %) по группам составила: при БА - 100,0 %, при ООБ - 46,7 %, в группе сравнения - 0 % (P1-3<0,05; Р2-3<0,05; P1-2<0,05). По данным многих исследователей, такое большое количество детей с эозинофилией ИМ в группе ООБ можно объяснить тем, что у части этих детей либо сформировалась, либо формируется БА, так как по данным Holgate ST (2002) изменения на уровне бронхиального дерева начинаются задолго, иногда за 4 года до появления типичных приступов БА. Обращают на себя внимание большее содержание нейтрофилов, и меньшее - макрофагов по сравнению с показателями, описанными в литературе для детей старшего возраста и взрослых [2, 7, 12]. Помимо клеточного состава, у части детей проводилось исследование иммунологических показателей ИМ (таблица 3).
Таблица 3
Иммунологические показатели индуцированной мокроты обследованных детей, Ме; 25-75 %
Показатель |
Группа 1 ООБ n=19 |
Группа 2 БА n=10 |
Группа 3 группа сравнения n=13 |
Белок, мг% |
3,69 2,2-4,69 |
2,67 1,75-3,90 |
3,39 2,92-4,28 |
sIgA, мкг/мг белка |
91,44 62,0-151,0 |
126,45* 80,56-192,96 |
76,52 58,46-103,40 |
IgМ, мкг/мг белка |
0,94 0,39-1,61 |
1,56 0,92-2,37 |
1,4 0,57-1,77 |
IgG, мкг/мг белка |
4,8 2,47-5,47 |
3,44 2,72-5,43 |
2,94 2,21-4,54 |
IgG1, мкг/мг белка |
1,94 1,28-3,0 |
2,23 0,93-3,34 |
2,5 1,52-3,6 |
IgG2, мкг/мг белка |
1,49* 0,61-2,84 |
1,08* 0,68-2,1 |
0,59 0,34-0,73 |
IgG3, мкг/мг белка |
0,35 0,16-0,52 |
0,53 0,18-0,75 |
0,36 0,17-0,70 |
IgG4, мкг/мг белка |
0,24* 0,11-0,36 |
0,31* 0,12-0,52 |
0,02 0-0,06 |
IgE, ME/мг белка |
1,05 0,31-1,76 |
0,93 0,37-3,08 |
0,44 0-0,89 |
IL-4, пг/мг белка |
5,37* 3,23-8,13 |
10,95* 5,88-16,7 |
0,57 0-1,86 |
IL-13 пг/мг белка |
2,02 1,35-5,05 |
4,60* 2,35-6,38 |
1,09 0-3,76 |
IL-8, пг/мг белка |
128,40* 57,06-243,0 |
129,56* 98,0-162,86 |
18,18 3,19-24,19 |
TNFa, пг/мг белка |
1,0 0,48-2,55 |
6,36* 2,67-11,3 |
0,98 0,59-3,25 |
IFNγ пг/мг белка |
5,19* 1,87-13,17 |
3,98* 1,74-7,97 |
14,87 2,8-22,67 |
Примечание. Значимость различий (р<0,05): * - с группой сравнения.
Выявлено, что группы БА и ООБ не отличались между собой ни по одному показателю, в обеих группах оказались высокими уровни IgG2 (в 1,8 и 2,5 раза выше соответственно, чем в группе сравнения, р<0,05), IgG4 (в 15 и 12 раз соответственно, р<0,05), IL-4 (в 19,2 и 9,4 раза соответственно, р<0,05), IL-8 (в 7,1 раза, р<0,05), IgE (в 2,1 и 2,4 раза соответственно, р>0,05), т.е. тех показателей, которые принимают участие в аллергическом воспалении, и низкими - IFNγ (в 3,7 и 2,9 раза соответственно, р<0,05) - цитокина, который обладает антиаллергическим эффектом и подавляет продукцию IgE клетками, стимулированными IL-4. Уровень IL-13, играющего центральную роль при аллергическом воспалении, ключевые свойства которого - переключение В-лимфоцитов на синтез IgЕ, активация эозинофилов, индукция бронхиальной гиперреактивности, гиперсекреции слизи - был наиболее высоким в группе БА (р<0,05 с группой сравнения); в группе ООБ - достоверно не отличался от других групп, но все же был в 1,9 раза выше, чем в группе сравнения. Содержание провоспалительного цитокина - TNFa, также было наибольшим в группе БА - в 6 раз выше, чем в других. Выявленные особенности иммунологических показателей ИМ у детей исследуемых групп соотносятся с данными, полученными другими исследователями у более старших детей и взрослых в ИМ, бронхоальвеолярном лаваже, биоптатах бронхов и слюне [6, 7, 10, 11, 13].
Корреляционный анализа показал, что стандартные лабораторные показатели (эозинофилы ОАК, общий IgE) и уровень эозинофилов в ИМ слабо коррелируют между собой, поэтому эти показатели не являются взаимозаменяемыми. Так же в нашем исследовании обнаружена положительная корреляционная связь содержания эозинофилов в ИМ и уровнями IL-4 и TNFα (r=0,334, p=0,04 и r=0,478, p=0,02 соответствено), а также уровня IL-4 и IgE (r=0,401, p=0,01) в ИМ.
Нарушения регуляции иммунного ответа, дисбаланс и гиперпродукция цитокинов имеют прямое отношение к формированию системной атопии у детей. Однако в настоящее время становится все яснее, что взаимодействия между подтипами Т-клеток и выделяемыми ими цитокинами являются более сложными и отличаются в зависимости от нескольких факторов, включая возраст ребенка и подействовавший стимул [7, 11, 12, 13].
Выводы:
1. Лабораторные проявления аллергического ринита имели 81 % детей с впервые выявленной бронхиальной астмой и 57,3 % - с острым обструктивным бронхитом в анамнезе; повышенный уровень эозинофилов в индуцированной мокроте (≥2,5 %) был выявлен у 100 % и 46,7 % детей соответственно.
2. Слабо коррелируют между собой стандартные лабораторные показатели (эозинофилы крови, общий IgE крови) и уровень эозинофилов в индуцированной мокроте, поэтому эти показатели не являются взаимозаменяемыми.
3. Иммунологических показатели индуцированной мокроты группы с бронхиальной астмой и острым обструктивным бронхитом не отличались между собой ни по одному показателю, в обеих группах оказались высокими уровни IgG2, IgG4, IL-4, IL-8, IgE и низкими - IFNγ относительно группы детей без аллергических заболеваний. В группе с бронхиальной астмой также выявлено повышение IL-13, TNFa и sIgA (р<0,05 с группой сравнения). Обнаружена положительная корреляционная связь содержания эозинофилов в индуцированной мокроте и уровнями IL-4 и TNFα, а также уровня IL-4 и IgE. в мокроте.
4. Так как у 100 % детей с бронхиальной астмой выявлен уровень эозинофилов в ИМ ≥2,5 %, дети без установленного диагноза бронхиальной астмы и с уровнем эозинофилов в индуцированной мокроте ≥2,5 % относятся к группе высокого риска по ее формированию, за ними необходимо наблюдение в динамике с исследованием клеточного состава индуцированной мокроты [3].
Рецензенты:
Федоров И. А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой факультетской педиатрии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;
Степанов О. Г., д.м.н., профессор кафедры факультетской педиатрии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.