Эффективным молекулярным методом диагностики гриппа птиц является метод полимеразой цепной реакции (ПЦР) [1]. ФБУН ЦНИИ эпидемиологии совместно с ФГБУ ВГНКИ разработана тест-система «Грипп» для ветеринарных целей, позволяющая обнаруживать РНК вируса гриппа А и идентифицировать субтипы с использованием как электрофоретического способа детекции, так и гибридизационно-флюоресцентной детекции в форматах реального времени (например, с помощью амплификаторов «Rotor Gene» 3000/6000, «iQ5» или «iCycler iQ») и по конечной точке (с помощью детекторов «АЛА-1/4» или «Джин») [2]. Для эффективного использования рабочего времени ветеринарных специалистов, занятых постановкой ПЦР при диагностике инфекционных болезней мелких домашних животных разработаны нормы времени на осуществление реакции электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле и в режиме реального времени [3] и постановку ПЦР при описторхозе плотоядных животных [4].
Цель исследования. Разработка норм времени методом полимеразной цепной реакции с использованием различных его вариаций при диагностике гриппа птиц.
Материал и методы исследования. Исследования проводились в отделе вирусологии и генно–молекулярной диагностики ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория». В качестве модели изучения выбрана диагностика гриппа птиц методом полимеразой цепной реакции с использованием различных методов: 1) постановка ПЦР электрофоретическим методом – формат EPh; 2) постановка ПЦР в режиме реального времени – формат FRT; 3) постановка ПЦР по конечной точке – формат FEP. Исследования проводили в несколько этапов: 1) изучение лабораторного оборудования при диагностике болезней птиц; 2) определение видов и методов диагностики вируса птичьего гриппа; 3) определение графика проведения хронометражных и фотохронометражных исследований; 4) изучение затрат труда на фотохронометражные и хронометражные исследования при постановке ПЦР на гриппа птиц; 5) анализ полученных результатов; 6) апробация полученных норм времени в лаборатории. Было проведено 31 хронометражное и 25 самохронометражных наблюдения и моделирование опыта с марта по август 2015 года с соблюдением требований Методических рекомендаций по нормированию труда ветеринарных специалистов (Одобрено НТС МСХ РФ 26 декабря 2014 г.). При постановке ПЦР ветеринарные специалисты отдела руководствовались «Инструкцией по применению тест-системы «ГРИПП» для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом полимеразой цепной реакции» (производитель: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва), методическими указаниями МУ 1.3.2569 – 09. Нормы времени устанавливали для шести форматов постановки ПЦР на грипп птиц.
Обычно с птицеводческих хозяйств биологический материал поступает партиями от 10 и более проб одновременно. В качестве наиболее распространенного количества одновременно проводимых исследований мы брали 10 проб. Независимо от количества одновременно участвующих в постановке ПЦР образцов каждый раз проводили постановку положительных и отрицательных контролей (2 образца).
Результаты исследования и их обсуждение. В отделе вирусологии и генно–молекулярной диагностики ФГБУ «Татарская МВЛ» ежегодно проводится 3357 исследований на грипп птиц, в том числе методом ПЦР – 265. Проведению хронометражного исследования предшествовала предварительная подготовка хронометристом: тщательное изучение постановки ПЦР в различных вариациях; подготовка хронометражных листов и секундомера; согласование графика проведения исследований с руководством ФГБУ «Татарская МВЛ» и сотрудниками отдела вирусологии и генно–молекулярной диагностики. Осуществлены хронометражные наблюдения за работой четырех опытных ветеринарных врачей со стажем более 3-х лет.
Биологическим материалом для исследования служили помет; мазки из клоаки или с глотки и трахеи; трахеальные смывы; внутренние органы, мясо птицы, субпродукты; яйцо больной (подозреваемой в заболевании) птицы. Мазки и смывы для постановки ПЦР использовали без предварительной обработки. Остальной биологический материал подвергался предварительной обработке.
Постановку ПЦР осуществляли два ветеринарных специалиста, первый проводил исследования в 1 и 2 зонах, с переходом с одной зоны в другую с предварительной сменой одежды. Второй специалист работал в 3 зоне, где проводил детекцию продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле и осуществлял учет и интерпретацию полученных результатов.
Разработаны нормы времени на подготовку биологического материала одной пробы, при одновременной подготовке 10 и 20 проб. Затраты времени ветеринарного специалиста на подготовку 1 пробы помета к исследованию составили 4,4 мин., 10 проб – 14,6 мин., 20 проб – 26,5 мин. Ветеринарный специалист на подготовку пробы внутренних органов, мяса, субпродуктов затрачивает 4,6, 17,7 и 32,7 мин.; яйца – 4,5, 16,9, 31,1 мин. соответственно. В зависимости от количества одновременно подготавливаемых проб затраты времени на подготовку одной пробы заметно сокращаются. Стандартные отклонения нормы времени составляют во всех случаях не более 2,0 %. В качестве модели нормы времени при подготовке всех видов биологического материала при диагностике гриппа птиц методом ПЦР использовали средние затраты труда ветеринарного специалиста, что составило при исследовании 1 пробы – 4,2 мин., 10 проб – 13,3 мин., 20 проб – 24,0 мин. Наблюдается заметная экономия времени на подготовку биоматериала с увеличением количества одновременно исследуемых проб.
Диагностику гриппа птиц методом ПЦР разными способами постановки реакции всегда начинают с выявления генома вируса Influenza virus A. При обнаружении РНК вируса осуществляется дальнейшее исследование с типированием выявленного вируса. Расчеты затрат рабочего времени ветеринарных специалистов на постановку ПЦР при диагностике гриппа птиц приведены в таблице 1.
Таблица 1
Затраты рабочего времени ветеринарных специалистов на диагностику гриппа птиц методом ПЦР в различных форматах при применении тест-системы «ГРИПП»
Форматы постановки ПЦР |
Затраты времени на исследование, мин. |
||
1 пробы |
10 проб |
20 проб |
|
Формат EPh (выявление РНК вируса гриппа А) |
39,6 ±0,44 |
104,4±1,2 |
180,3±1,6 |
в том числе на 1 исследование |
39,6 |
10,4 |
9,0 |
Формат EPh (выявление РНК вируса гриппа А и идентификация субтипов H5 и H7) |
64,6±0,52 |
158,5±1,2 |
268,8±1,2 |
в том числе на 1 исследование |
64,6 |
15,9 |
13,4 |
Формат FEP (выявление РНК вируса гриппа А) |
29,7±0,53 |
93,1±1,0 |
166,7±1,6 |
в том числе на 1 исследование |
29,7 |
9,3 |
8,3 |
Формат FEP (выявление РНК вируса гриппа А и идентификация субтипов H5, H7 и H9) |
41,3±0,5 |
121,8±1,18 |
214,6±1,5 |
в том числе на 1 исследование |
41,3 |
12,2 |
10,7 |
Формат FRT (выявление РНК вируса гриппа А) |
27,6±0,43 |
87,9±0,8 |
158,9±1,23 |
в том числе на 1 исследование |
27,6 |
8,8 |
7,0 |
Формат FRT (выявление РНК вируса гриппа А и идентификация субтипов H5, H7 и H9) |
37,5±0, 5 |
112,4±0,72 |
201,1±1,0 |
в том числе на 1 исследование |
37,5 |
11,2 |
10,1 |
При исследовании единичной пробы методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле затраты времени ветеринарного врача составляют 39,6 мин. (выявление вируса гриппа А) и 64,6 мин. (идентификация субтипов вируса гриппа А); при одновременном исследовании 10 проб соответственно 104,4 и 158,5 мин., 20 проб – 180,3 и 268,8 мин. Затраты времени на одну пробу составили при одновременном исследовании 10 проб – 10,4 мин., 20 проб – 9,0 мин. (выявление вируса гриппа А) 15,9 и 13,4 мин. (идентификация субтипов вируса гриппа А). Увеличение количества затрачиваемого ветеринарным врачом времени при обнаружении РНК вируса гриппа А обусловлено идентификацией субтипов H5 и H7. Для продолжения реакции используют образцы РНК, давшие положительные результаты на наличие генома вируса гриппа A. При этом добавляются следующие этапы: проведение амплификации; детекция продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле; учет и интерпретация результатов; внесение результатов анализа в автоматизированную систему «Веста».
В структуре затрат рабочего времени при исследовании на грипп птиц в формате EPh (рисунок 1) при исследовании единичной пробы (отрицательная реакция) наибольший удельный вес занимает экстракция РНК из исследуемого материала (28,5 %) и детекция продуктов амплификации в агарозном геле (26,5 %), меньше – проведение амплификации (18,4 %) и постановка реакции обратной транскрипции (16,9 %). При одновременном исследовании 10 и 20 проб наибольший удельный вес приходится на экстракцию РНК – 49,9 и 54,9 %, в то же время заметно уменьшаются затраты времени, связанные с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле – 14,0 и 10,9 % соответственно. Наблюдается так же уменьшение затрат времени при проведении амплификации и постановка реакции обратной транскрипции. Затраты времени, связанные с учетом интерпретации полученных результатов занимают в пределах десяти процентов и возрастают прямо пропорционально объемам одновременно проводимых исследований.
При выявлении вируса гриппа птиц постановка реакции продолжается – идет типирование выявленного вируса. При этом структура рабочего времени ветеринарного специалиста не меняется, однако, изменяются объемы выполняемых работ в зоне 2 и 3 за счет включения повторных этапов ПЦР. Так, при исследовании единичной пробы в структуре работ наибольший удельный вес занимает детекция продуктов амплификации в агарозном геле – 33,7 % и проведение амплификации – 26,2 %. Соответственно, увеличиваются затраты времени, связанные с учетом, интерпретацией и занесением полученных результатов в автоматизированную систему «Веста» (12,2 %). Аналогичные изменения наблюдаются в структуре затрат рабочего времени ветеринарного специалиста, осуществляющего одновременные исследования 10 и 20 проб.
Затраты рабочего времени ветеринарного врача, проводящего исследование на грипп птиц методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле как при отрицательной, так и при положительной реакции постановка ПЦР занимает от 32,58 % (при исследовании 1 пробы, отрицательной реакции) до 72,3 % (при исследовании 20 проб, отрицательной реакции). Соответственно подготовительно-заключительные работы составляют от 27,7 до 67,4 %. Следует отметить, что наблюдается заметное сокращение затрат времени ветеринарного специалиста, связанные с обслуживанием рабочего места при одновременном исследовании 10 и 20 проб как при получении отрицательной реакции, так и при положительной реакции (когда дальнейшая работа сопряжена с типизацией вируса гриппа А).
Рис.1. Структура затрат рабочего времени ветеринарного врача при применении тест-системы «ГРИПП» для выявления вируса гриппа птиц (Influenza virus A) методом ПЦР в формате EPh
Аналогичным образом осуществлен анализ затрат рабочего времени ветеринарного врача при исследовании на грипп птиц методом ПЦР по конечной точке (формат FEP) и в режиме реального времени (формат FRT). Затраты времени ветеринарного специалиста при исследовании на грипп птиц в формате FEP при исследовании единичной пробы на выявление вируса гриппа А составляет 29,7 мин., при одновременном исследовании 10 проб – 93,1 и 20 проб – 166,7 мин., при идентификации субтипов вируса гриппа А 41,3, 121,8 и 214,6 мин. соответственно.
При проведении исследований на выявление вируса гриппа А методом ПЦР по конечной точке в структуре затрат рабочего времени ветеринарного специалиста на исследование 1 пробы экстракция РНК из исследуемого материала занимает 38,4 %, проведение обратной транскрипции – 22,6 % и амплификации – 17,2 %. По сравнению с постановкой реакции ПЦР в формате EPh заметно сокращается время, затрачиваемое на детекцию (14,6 %), так как последнее осуществляется с применением флюоресцентного ПЦР детектора «Джин-4». Завершение работы с внесением полученных результатов в автоматизированную систему «Веста» занимает 16,9 % времени. При одновременном исследовании как 10, так 20 проб ветеринарный специалист больше времени затрачивает на работу в 1 зоне (экстракция РНК из исследуемого материала) – 56,5 и 60,1 %, меньше – на детекцию результатов 6,4 и 5,4 % соответственно. При идентификации субтипов (H5, H7 и H9) вируса гриппа А структура затрат рабочего времени ветеринарного специалиста внешне похоже на структуру затрат рабочего времени при выявлении вируса гриппа А.
Норма времени на выявление вируса гриппа птиц с применением тест-системы «ГРИПП» методом ПЦР в режиме реального времени (формат FRT) при исследовании 1 пробы составляет 27,6 мин., при идентификации субтипов (H5, H7 и H9) вируса гриппа А – 37,5 мин. В структуре затрат рабочего времени при отрицательной реакции приходится на экстракцию РНК вируса из исследуемого материала – 41,3 %, завершение работы – 12,7 %; при положительной реакции на проведение амплификации затрачивается 33,2 %, постановку обратной транскрипции – 17,8 %. При одновременном исследовании 10 и 20 проб затраты времени при выявлении вируса гриппа А (отрицательная реакция) составляют 87,9 и 112,4 мин., продолжении реакции с типизацией вируса соответственно 158,9 и 201,1 мин.. Экономия времени при одновременном исследовании 10 и 20 проб происходит при постановке реакции обратной транскрипции и проведении амплификации с применением амплификатора «Rotor Gene».
Метод полимеразной цепной реакции является одним из наиболее эффективных методов диагностики болезней животных и птиц. Материально-техническое оснащение лаборатории ФГБУ «Татарская МВЛ» позволило провести исследования и разработать нормы времени в трех различных режимах: электрофоретическим методом, в режиме реального времени и по конечной точке. Разработке норм времени предшествовала тщательная подготовка. Были проведены хронометражные исследования за процессом проведения ПЦР в различных режимах, однако исследования, связанные с хронометрированием «положительных» проб, в основном моделировались или опытные ветеринарные специалисты лаборатории составляли самохронометражные листы, так как за период исследования выявления вируса гриппа А (Influenza virus A) не было. Таким образом, разработаны нормы времени при исследовании на грипп птиц с использованием тест-система «Грипп» в трех вариациях и в каждой вариации постановки ПЦР норма времени в двух вариантах: 1) выявление РНК вируса гриппа А; 2) выявление РНК вируса гриппа А и идентификация субтипов вируса гриппа А.
Выводы:
1. Метод полимеразной цепной реакции является эффективным методом диагностики болезней животных и птиц.
2. Оптимальное количество одновременно исследуемых проб методом ПЦР в условиях ветеринарных лабораторий 10 и более, это позволяет экономить время ветеринарного специалиста за счет сокращения отдельных рабочих процессов во время постановки реакции.
3. Ветеринарный специалист при исследовании на грипп птиц с использованием тест-система «Грипп» методом ПЦР в режиме реального времени (формат FRT) затрачивает наименьшее время, что составляет при выявлении вируса гриппа А при исследовании единичной пробы 27,6 мин, 10 проб – 87,9 и 20 проб – 158,9 мин., при типизации вируса – соответственно 37,5, 112,4 и 201,1 мин.
Рецензенты:
Василевский Н.М., д.вет.н., профессор, заместитель директора по НИР ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань;
Галиуллин А.К., д.вет.н., профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», г. Казань.