Развитие современных технологий в биомедицинских науках значительно расширяет методологическиевозможности ученого в совершенствовании и углублении знаний об этиологии, патогенезе и лечении различных заболеваний. Большой интерес представляет применение продуктов нанотехнологического прогресса для диагностики и лечения патологических процессов, в частности речь идет о наноалмазах детонационного синтеза[10]. Данные наночастицы имеют алмазное ядро из углерода, размером 4-5нм, покрытое снаружи различными химически активными группами. Небольшие размеры частиц и высокая химическая активность поверхности обеспечивают этому наноматериалу высокую сорбционную емкость - 1 грамм наноалмазов может сорбировать на себя до 0,5 граммов белка. Таким образом, наноалмазы можно использовать как сорбент при различных патологиях, требующих высокий уровень связывания и выведения различных нежелательных для организма веществ, в том числе и органической природы. Можно предполагать, что наноалмазы найдут свое применение как носитель лекарственных средств, энтеросорбент, раневое покрытие для инфицированных ран, для лечения гнойных перитонитов и т.п.[5,6]. Предварительные исследования показали, что наноалмазы обладают высокой биологической совместимостью[9].
Целью исследования было выявить реакцию организма экспериментальных животных на интраперитонеальное введение гидрозолей наноалмазов.
Материалы и методы исследования
В работе использовали наноалмазы, полученные в НПО «Алтай» (г. Бийск). Но данный наноматериал обладал существенным недостатком, общим для подавляющего большинства используемых наноалмазов - низкой коллоидной устойчивостью, что не позволяло получить устойчивый гидрозоль наночастиц, который можно было бы простерилизовать для инъекционного введения в полость брюшины без ухудшения качества гидрозоля. Поэтому проводили дополнительную очистку поверхности наночастиц по запатентованной методике [7,8]. В результате получали наноалмазы, которые способны образовывать устойчивые гидрозоли, и невыпадающие в осадок даже после стерилизации.
В работе использовали гидрозоль наноалмазов концентрации 0,002 вес.%, который получали простым добавлением деионизованной воды к навеске порошка наноалмазов. Затем гидрозоль разливали в чистую стеклянную тару, герметично укупоривали резиновой пробкой с алюминиевой обкаткой и стерилизовали в автоклаве.
В качестве экспериментальных животных использовали инбредных белых лабораторных мышей весом 26-28 грамм, самцов.
Животных случайным образом распределили на 3 группы:
1 группа - 11 животных - вводили 0,002 вес.% гидрозоль наноалмазов в полость брюшины.
2 группа - 10 животных - вводили деионизованную воду в полость брюшины.
3 группа - 10 животных - в полость брюшины ничего не вводили (контрольная группа).
Работу с экспериментальными животными осуществляли в виварии Красноярского государственного медицинского университета им.проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого с соблюдением требований гуманного обращения с экспериментальными животными согласно «Руководству по лабораторным животным иальтернативным моделям в биомедицинских технологиях» [2] после разрешения Локального Этического комитета ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. Ф.В. Войно-Ясенецкого Минздрава РФ (протокол № 26/2010 от 24.09.2010г).
Животных наркотизировали эфиром, обрабатывали переднюю брюшную стенку 70-градусным этиловым спиртом, и инсулиновым шприцем в полость брюшины вводили 1 мл гидрозоля наноалмазов или деионизованной воды, согласно распределению животных по группам. После пробуждения отсаживали животное в клетку. Через 72 часа после инъекции животное выводили из эксперимента путем дислокации позвоночника в шейном отделе.В полость брюшины вводили 5 мл раствора Хенкса, после чего массировали животному живот в течение 2 минут. После массажа откачивали с помощью шприца содержимое полости брюшины, из которого выделяли перитонеальные макрофаги, основываясь на их быстрой адгезии к стенкам культурального сосуда[3].
Клеточную суспензию с макрофагами наносили на обезжиренное предметное стекло, покрывали покровным стеклом и микроскопировали на микроскопе NikonEclipseNi-Uс насадкой для фазового контраста (увеличение х1000,масляная иммерсия). При микроскопии оценивали состояние плазмолеммы макрофагов, по морфологии которой выделяли 4 вида клеток и подсчитывали их количество: интактные макрофаги, макрофаги в состоянии начального блеббинга, макрофаги в состоянии терминального блеббинга, некротизированные макрофаги. Производили подсчет клеток в нескольких полях зрения (не менее 100 клеток от каждого животного). Полученные данные заносили в протокол исследования в формате электронной таблицы Excel, вычисляли процентное соотношение клеток по 4 видам для каждого животного. Также мы вычисляли индекс блеббинга макрофагов- выраженное в процентах отношение макрофагов в состоянии терминального блеббинга к количеству макрофагов в состоянии начального и терминального блеббинга.
Кроме этого, были взяты фрагменты тонкой кишки и передней брюшной стенки для исследования висцеральной и париетальной брюшины. Образцы органов фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 24 часов, затем пропитывали парафином в автоматизированном гистологическом процессоре LeicaTP1020, заливали в парафиновые блоки, и изготавливали парафиновые срезы толщиной 5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по методу Ван Гизон по стандартным протоколам [4]. Полученные гистологические препараты подвергали обзорной микроскопии на микроскопе NikonEclipseNi-Uс системой фото-видеодокументацииNikonDS-Fi2 и морфометрии с помощью программы JMicroVision 1.2.7.В препаратах измеряли толщину париетальной (передняя брюшная стенка) и висцеральной брюшины (тонкая кишка) в 5 полях зрениях от каждого животного, не менее 5 измерений в каждом поле зрения.
Для численного представления полученных параметров использовали медиану и квартили Me [Q1;Q3], сравнение проводили с помощью непараметрических методов статистики[1]. Так как было больше двух групп сравнения, то сначала мы использовали дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса (Kruskel-Wallis), который показал наличие различий показателей между группами. Далее для попарного сравнения использовали критерий Манна-Уитни (U-test) с поправкой Холма. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
При исследовании состояния перитонеальных макрофагов экспериментальных животных при интраперитонеальном введении гидрозолей наноалмазов был выявлено, что количество интактных клеток статистически значимо больше, чем некротизированных и клеток в состоянии блеббинга разной степени выраженности (р<0,01). Количество некротизированных клеток статистически значимо меньше, чем интактных и в состоянии блеббинга различной степени выраженности (р<0,01). Статистически значимых различий между количеством клеток в состоянии начального и терминальнного блеббинга не выявлено (р=0,97) (табл. 1).
Таблица 1
Соотношение перитонеальных макрофагов в различной степени блеббинга, в % (Me[Q1;Q3])
|
Состояние плазмолеммы перитонеальных макрофагов |
Группа животных |
||
|
Введение 1мл 0,002 вес.% гидрозоля наноалмазов |
Введение 1мл деионизованной воды |
Контрольные (интактные) животные |
|
|
Интактные макрофаги |
37,50[34,23;45,58] |
63,83[58,47;66,06] р1=0,0001 |
68,64[66,67;72,73] р1=0,0001 р2=0,006 |
|
Начальный блеббинг |
25,16[20,69;26,00] |
24,32[20,91;27,18] р1=0,97 |
21,68[16,83;24,51] р1=0,14 р2=0,15 |
|
Терминальный блеббинг |
24,32[19,00;27,67] |
8,87[7,77;10,62] р1=0,0003 |
5,79[4,59;8,91] р1=0,0002 р2=0,02 |
|
Некротизированные макрофаги |
10,60[6,00;14,00] |
4,61[3,54;5,74] р1=0,002 |
2,86[2,44;3,92] р1=0,0001 р2=0,03 |
|
Индекс блеббинга |
46,77[42,22;56,10] |
28,02[25,81;30,00] р1=0,0006 |
21,36[19,23;27,59] р1=0,0003 р2=0,04 |
Примечание: р1 - уровень значимости «р» при сравнении с группой животных, которым вводили гидрозоль наноалмазов. р2 - уровень значимости «р» при сравнении с группой животных, которым вводили деионизованную воду.
После введения деионизованной воды в полости брюшины экспериментальных животныхинтактных макрофагов наблюдается статистически значимо больше (р<0,01), а клеток в состоянии некроза статистически значимо меньше (р<0,01). При этом клеток в состоянии начального блеббинга больше, чем в состоянии терминального (р<0,01) (табл. 1).
У животных контрольной группы, которым в полость брюшины ничего не вводили, количество интактных клеток статистически значимо больше, чем клеток в состоянии блеббинга и некротизированных (р<0,01). Некротизированных клеток наименьшее количество (р<0,01). Макрофагов в состоянии начального блеббинга больше, чем в состоянии терминального (р<0,01)(табл. 1).
При сравнении видов клеток у разных групп животных отмечается, что интактных макрофагов статистически значимо больше в контрольной группе животных, в группе животных, которым вводили гидрозоли наноалмазов интактных клеток наименьшее количество (табл. 1).
Количество перитонеальных макрофагов в состоянии начального блеббинга не имело статистически значимых различий у животных всех групп (табл. 1).
Перитонеальные макрофаги в состояниитерминального блеббинга в наибольшем количестве определяются в группе животных, которым вводили гидрозоль наноалмазов в полость брюшины. Наименьшее количество макрофагов в состоянии терминального блеббинга наблюдается в контрольной группе животных (табл. 1).
Некротизированные макрофаги также в наибольшем количестве выявлены в группе животных, которым интраперитонеально вводили наночастицы. В контрольной группе некротизированные макрофаги встречаются редко (табл. 1).
При расчете индекса блеббинга было установлено, что статистически значимое наибольшее значение этого показателя наблюдается при введении экспериментальным животным гидрозоля наноалмазов, наименьшее - у животных контрольной группы(табл. 1).
При микроскопии брюшины животных, которым вводили гидрозоль наноалмазов, отмечается отек соединительнотканной пластинки, мезотелия. Отдельные клетки мезотелия изменили плоскую форму на кубическую. В соединительнотканной пластинке наблюдается большое количество макрофагов с примесью лимфоцитов. У животных, которым в полость брюшины вводили деионизованную воду,реакция брюшины менее выражена: наблюдается слабовыраженный отек брюшины, отечный мезотелий встречается на небольшом протяжении, в соединительнотканной пластинке макрофаги и лимфоциты встречаются в единичном количестве.
При сравнении толщины брюшины отмечается статистически значимое увеличение как висцеральной, так и париетальной брюшины у животных, которым вводили гидрозоль наноалмазов (табл. 2).
Таблица 2
Толщина париетальной и висцеральной брюшины, в мкм (Me[Q1;Q3])
|
Толщина брюшины (мкм) |
Группа животных |
||
|
Введение 1мл 0,002 вес.% гидрозоля наноалмазов |
Введение 1мл деионизованной воды |
Контрольные (интактные) животные |
|
|
Париетальная брюшина |
12,37[8,32;15,71] |
8,59[6,37;11,31] р1<0,01 |
5,56[4,56;7,39] р1=0,00 р2<0,01 |
|
Висцеральная брюшина |
3,92[3,11;5,06] |
3,15[2,70;3,88] р1<0,01 |
1,86[1,51;2,25] р1=0,00 р2=0,00 |
Примечание: р1 - уровень значимости «р» при сравнении с группой животных, которым вводили гидрозоль наноалмазов. р2 - уровень значимости «р» при сравнении с группой животных, которым вводили деионизованную воду.
Введение деионизованной воды также вызывает статистически значимое утолщение париетальной и висцеральной брюшины, но в гораздо меньшей степени, чем при введении наночастиц (табл.2).
Заключение
Обобщая полученные нами данные, можно сделать заключение о том, что, несмотря на высокую биологическую совместимость наноалмазов детонационного синтеза, введение данных наночастиц в виде стерильного гидрозоля концентрации 0,002 вес.%вызывает реакцию со стороны брюшины, проявляющуюся в виде ёё отека, инфильтрации клетками макрофагального и лимфоидного ряда, увеличении содержания перитонеальных макрофагов в состоянии терминального блеббинга и некроза в экссудате из полости брюшины. Увеличение процентного содержания перитонеальных макрофагов в состоянии терминального блеббинга и некроза происходит за счет уменьшения доли интактных клеток в выделенной клеточной популяции, в связи с чем происходит увеличение индекса блеббинга. Кроме этого, аналогичные реактивные изменения со стороны брюшины мы обнаружили и при введении в ее полость деионизованной воды, хотя и в гораздо меньшей степени. Следовательно, вполне закономерным является предположение, что реакция организма экспериментальных животных на введение гидрозоля наноалмазов в концентрации 0,002 вес.% складывается из двух факторов - наличия наночастиц и крайне низкого осмотическогодавлениядисперсионной среды (деионизованной воды). Таким образом, для уменьшения влияния золей наноалмазов детонационного синтеза на серозную оболочку брюшной полости и активацию перитонеальных макрофагов можно рекомендовать вводить интраперитонеально данные наночастицы в дисперсионной среде, имеющей осмотическое давление, приближенное к физиологическим показателям.
Авторы выражают искреннюю признательность и благодарность за помощь в проведении исследования заведующей кафедрой биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ, д.м.н., проф. Салминой Алле Борисовне и профессору кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ, д.м.н., Малиновской Наталии Александровне; за предоставление стерильных гидрозолей наноалмазов детонационного синтеза заведующему лабораторией нанобиотехнологии и биолюминесценции ИБФ КНЦ СО РАН (г.Красноярск), д.б.н. Бондарю Владимиру Станиславовичу, старшему научному сотруднику лаборатории нанобиотехнологии и биолюминесценции ИБФ КНЦ СО РАН (г.Красноярск) Пузырю Алексею Петровичу.
Рецензенты:Али-Риза А.Э., д.м.н., профессор кафедры патологической анатомии им. проф. П.Г. Подзолкова с курсом ПО ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, г. Красноярск;
Савченко А.А., д.м.н., профессор, руководитель лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии ФГБНУ «Научно-исследовательского института медицинских проблем Севера», г. Красноярск.