Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Лекарственное растительное сырье, содержащее флавоноиды, широко применяется в медицинской практике в качестве источника желчегонных, гепатопротекторных, антиоксидантных, ангиопротекторных, диуретических, противовоспалительных, противоязвенных, спазмолитических, гемореологических и других лекарственных средств [5,7].

Богато флавоноидами семейство Ивовых, объединенных в три рода – тополь (PopulusL.), ива (SalixL.) и чозения (ChoseniaNac). На территории России весьма распространен род Ива (более 80 видов), представители которого играют важную роль в формировании растительного покрова, принадлежат к доминирующим ландшафтным видам в местах повышенного увлажнения, а также успешно культивируются [2]. Принято считать, что основное действие коры ивы – противовоспалительное– обусловлено, прежде всего, содержанием в ней салицина, который в ходе метаболизма превращается в салициловую кислоту. Однако, по современным экспериментальным данным, наряду с салицином выраженную фармакологическую активность проявляют и полифенольные соединения [11]. Также экспериментально доказано, что побеги ивы белой проявляют противовоспалительную активность, сопоставимую с корой, несмотря на сравнительно низкое содержание в них салицина [10]. Это свидетельствует, что эффект обеспечивается всем комплексом биологически активных веществ (БАВ), в том числе и флавоноидами, и указывает на необходимость исследований данной группы соединений в различных представителях рода Ива.

За последние годы проводился ряд научных исследований отечественных видов ивы. А.И. Бонцевичем проведен химический анализ коры ивы остролистной (S. acutifoliaWilld.) [1]. О.О. Хитевой изучен химический состав коры и однолетних побегов ивы белой (Salixalba L.), коры ивы трехтычинковой (S. triandra L.) и ивы пурпурной (S. purpurea L.) [10]. Во всех указанных объектах были обнаружены флавоноиды, при этом их содержание оказалось достаточно высоким (например, в коре ивы остролистной- 2,8%, а в побегах ивы белой -1,4%).В связи с этим актуальным является изучение и других отечественных видов ивы с целью расширения сырьевой базы и получения ценного противовоспалительного средства.

Цель работы – обнаружение и количественное определение флавоноидов в коре и побегах ивы вавилонской (Salixbabylonica L.) и ее гидрида с ивой белой (Salixbabylonica х alba L.).

Материал и методы исследования

Объектами исследования являются высушенные и измельченные до размера 1 мм кора и однолетние побеги (ветви длиной до 50 см) ивы вавилонской (Salixbabylonica L.) и ее гибрида с ивой белой (Salixbabylonica х alba L.), собранные в Ставропольском крае в разное время года с 2012 по 2015 г.

Для обнаружения флавоноидов в исследуемых образцах готовили извлечение: 1,0 г сырья заливали 20 мл спирта этилового 70 % и нагревали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут, далее проводили качественные реакции общепринятыми реактивами [3,6,8]. Идентификацию флавоноидов методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) проводили в спиртовых извлечениях в системе растворителей н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2) [3,5]. На хроматографические пластинки «Сорбфил УФ-254» наносили по 30мкл спиртовых извлечений коры, по 20 мкл спиртовых извлечений побегов ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой и по 5 мкл 0,05 % спиртовых растворов стандартных образцов (СО) рутина, геспередина, лютеолина, кверцетина, нарингенина, изосалипурпозида. После хроматографирования пластинки подсушивали и просматривали в видимом и УФ свете. Идентификацию пятен проводили, обрабатывая хроматограммы 5 % спиртовым раствором алюминия хлорида.

Для установления оптимальных условий экстракции использовали различные условия экстрагирования, изменяя вид экстрагента, время экстракции, соотношения сырья и экстрагента, однократную и дробную экстракцию.

Для количественного определения флавоноидов в коре и побегах ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой использовали методику дифференциальной спектрофотометрии, основанную на образовании комплекса с алюминия хлоридом [4].

Валидационные испытания проводили в соответствии с проектом ОФС 42-0113-09 «Валидация аналитических методик» [9].При построении градуировочного графика для определения линейности методикиразличные объемы раствора А (1мл; 2,5 мл; 5мл; 7,5 мл; 10 мл) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, и далее проводили определение как описано в методике количественного определения.При определении правильности использовали метод добавок (5 млраствора Апомещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и добавляли 0.05 % спиртовый раствор СО рутина (0,5; 0,75 и 1 мл), и далее проводили определение как описано в методике количественного определения.

Результаты исследования и их обсуждение

С помощью качественных реакций обнаружили в коре ивы вавилонской и ее гибрида, а также в побегах гибрида флавонолы, флаваноны, флавоны и катехины, а в побегах ивы вавилонской – флавонолы, флаваноны и флавоны. С помощью метода ТСХ удалось идентифицировать в коре и побегах ивы вавилонской рутин, лютеолин, нарингин; в коре гибрида рутин и кверцетин, а в побегах гибрида рутин, кверцетин и нарингин.

При изучении условий экстракции флавоноидов оказалось, что наиболее полное извлечение флавоноидов достигается при соотношении сырья и экстрагента 1:100, использовании в качестве экстрагента спирта этилового 70 % и проведении трехкратной экстракции по 30 мл в течение 30 минут (табл. 1). Наличие в коре и побегах рутина (метод ТСХ) послужило основанием использовать его в качестве стандартного образца при разработке методики. Предварительно было определено, что максимум поглощения комплекса извлечения с 2 % раствором алюминия хлорида находится при 410±3 нм, что совпадает с максимумом поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом (412 нм). Результаты исследования устойчивости окраски комплекса флавоноидов с алюминия хлоридом свидетельствуют о том, что интервал времени, в течение которого происходит образование стабильного комплекса с алюминия хлоридом, составляет 40 минут, а время, при котором раствор стабилен и возможно измерение оптимальных показаний оптической плотности, составляет 80 минут от момента стабилизации окраски.

Таблица 1

Влияние условий экстракции на полноту извлечения суммы флавоноидов из сырья, заготовленного в октябре 2013 года

Для включения данной методики в проект нормативной документации на ЛРС устанавливали ее валидность по критериям специфичность, линейность, правильность, аналитическая область, прецизионность (повторяемость).

Валидационные испытания проводили на извлечениях из побегов ивы вавилонской, собранных в октябре 2013 года в Ставропольском крае.

Критерий специфичность определяли, используя метод добавок. Для этого к извлечению добавляли разные объемы 0,05 % стандартного раствора рутина. Наблюдалось увеличение поглощения при 410 нм пропорционально объему вносимой добавки (табл. 2).

Далее определения критерия линейности определяли уравнение регрессииy = b۰ х + α (х – концентрация определяемого вещества; y – величина отклика; b – угловой коэффициент; α – свободный член). В результате уравнение линейной регрессии имело вид: y = 932,48x + 0,0004, а значение коэффициента корреляцииrсоставило 0,995, что соответствует требованиям ОФС 42-0113-09 «Валидация аналитических методик» 0,99, то есть методика линейна.

Аналитическую область методики устанавливали по диапазону экспериментальных данных, находящихся в пределах от 0,0001255 г/мл до 0,0006479 г/мл.

Правильность методики определяли методом добавок. Рассчитанный критерий Стьюдентасоставил 2,11. Это значит, что выполняется неравенство tвыч.<tтабл(P,f), так как 2,11<4,30 и можно говорить о том, что результаты не отягощены систематической ошибкой, значит методика правильна (табл.2).

Таблица 2

Определение правильности методики спектрофотометрического определения суммы флавоноидов методом добавок

Прецизионность (повторяемость) методики определяли в 6 отдельных навесках сырья. При оценке полученных результатов ориентировались на рекомендации американской ассоциацией аналитической химии (АОАС), в соответствии с которыми показатель RSD не должен превышать 2 %. Результаты, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что показатель RSD составил 1,97 %, т.е. методика прецизионна.

Таблица 3

Результаты определения прецизионности методики определения суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии

Используя разработанную методику, определяли количественное содержание флавоноидов в коре и однолетних побегах изучаемых видов ив, заготовленных в различные сезоныгода(с 2012 года по 2015 год). Полученные данные приведены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты количественного определения суммы флавоноидов в исследуемых образцах сырья, собранных в различныесезоны 2012-2015 г

Как следует из представленных в таблице 4 данных, содержание флавоноидов в коре ивы вавилонской колеблется от 0,14 % до 0,46 % и оно выше, чем в коре гибрида ивы вавилонской и ивы белой (от 0,08 % до 0,16 %). Содержание флавоноидов в побегах ивы вавилонской колеблется от 0,74 % до 1,15 %, в побегах гибрида ивы вавилонской и ивы белой – от 0,75 % до 1,14 %. В побегах ив содержание флавоноидов значительно превышает их содержание в коре. В зависимости от сезона сбора содержание флавоноидов было не постоянным как в коре, так и в побегах. В разные годы сбора также наблюдается изменение в содержании. Тем не менее, полученные данные позволяют установить минимальные пределы содержания флавоноидов при составлении проектов нормативной документации (для побегов ивы не менее 0,7 %, для коры – не менее 0,08 %.

Выводы

1. С помощью метода ТСХ в коре и побегах ивы вавилонской идентифицированы рутин, лютеолин, нарингин; в коре гибрида – рутин и кверцетин, а в побегах гибрида – рутин, кверцетин и нарингин

2. Экспериментально подобраны оптимальные условия методики количественного определения суммы флавоноидов в объектах исследования (соотношение сырья и экстрагента 1:100, использование в качестве экстрагента спирта этилового 70%-ного и проведение трехкратной экстракции по 30 мл в течение 30 минут).

3. Разработанная методика является валидной по критериям специфичность, линейность, правильность, аналитическая область, прецизионность (повторяемость) и может быть использована для количественного определения суммы флавоноидов в коре и однолетних побегах ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой, а также рекомендована для включения в раздел «Числовые показатели» нормативного документа на данный вид лекарственного растительного сырья.

4. В коре ивы вавилонской содержание флавоноидов колеблется в пределах от 0,14 % до 0,46 %; в коре гибрида ивы вавилонской с ивой белой - от 0,08 % до 0,16 %. Содержание флавоноидов в побегах ивы вавилонской колеблется от 0,74 % до 1,15 %, в побегах гибрида ивы вавилонской с ивой белой – от 0,75 % до 1,14 %.

5. Содержание флавоноидов в образцах сырья, заготовленных в 2012-2015гг., не имеет четкой тенденции сезонных колебаний, но полученные данные позволяют установить минимальные пределы содержания флавоноидов при составлении проектов нормативной документации (для побегов ивы не менее 0,7 %, для коры – не менее 0,08 %).

Рецензенты:

Попова О.И., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры фармакогнозии, Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Пятигорск;

Кодониди И.П., д.фарм.н., доцент, профессор кафедры органической химии Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Пятигорск.