Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

FLAVONOIDS OF THE WEEPING WILLOW AND ITS HYBRID WITH WHITE WILLOW BARK AND BRANCHES

Dementeva T.M. 1 Kompantseva E.V. 2 Ayrapetova A.Yu. 2 Frolova O.O. 2
1 Far-Eastern State Medical University
2 Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute – a branch of the Volgograd State Medical University
Настоящая статья посвящена исследованию флавоноидов коры и побегов ивы вавилонской (SalixbabylonicaL.) и ее гибрида с ивой белой (Salixbabylonica х alba (S.SalamoniiCarriere)). С помощью метода тонкослойной хроматографии в исследуемых образцах идентифицированы несколько индивидуальных веществ. Экспериментально подобраны оптимальные условия методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в объектах исследования. Разработанная методика является валидной по критериям специфичность, линейность, правильность, аналитическая область, прецизионность (повторяемость). В коре ивы вавилонской содержание флавоноидов колеблется в пределах от 0,14 % до 0,46 %; в коре гибрида ивы вавилонской с ивой белой – от 0,08 % до 0,16 %. Содержание флавоноидов в побегах ивы вавилонской колеблется от 0,74 % до 1,15 %, в побегах гибрида – от 0,75 % до 1,14 %. Содержание флавоноидов в образцах сырья, заготовленных в 2012–2015 гг., не имеет четкой тенденции сезонных колебаний, но полученные данные позволяют установить минимальные пределы содержания флавоноидов при составлении проектов нормативной документации (для побегов ивы не менее 0,7 %, для коры – не менее 0,08 %).
The present article is dedicated to the study of flavonoids in the bark and branches of the weeping willow (Salix babylonica L.) and its hybrid with the white willow (Salix babylonica x alba (S. SalamoniiCarriere)). Several individual substances were identified in the samples using thin layer chromatography. The study tested the optimal conditions for quantitative determination of the total flavonoids content in the objects. The developed method is valid according to the criteria of specificity, linearity, accuracy, analytical area, precision (repeatability). In the weeping willow bark flavonoids content varies from 0.14 % to 0.46 %; in the bark of a hybrid – from 0.08 % to 0.16 %. The content of flavonoids in the weeping willow branches ranges from 0.74 % to 1.15 % and in the hybrid branches – from 0.75 % to 1.14 %. The content of flavonoids in the raw material samples harvested in 2012–2015, has no clear trends for seasonal variations, but the data obtained allow to establish minimum limits of the flavonoids content for the projects of normative documents (for willow branches not less than 0.7 %, for willow bark – no less than 0.08 %).
flavonoids
weeping willow (Salix babylonica L.)
hybrid of weeping willow with white willow (Salix babylonica х alba (S.Salamonii Carriere))
bark
branches

Лекарственное растительное сырье, содержащее флавоноиды, широко применяется в медицинской практике в качестве источника желчегонных, гепатопротекторных, антиоксидантных, ангиопротекторных, диуретических, противовоспалительных, противоязвенных, спазмолитических, гемореологических и других лекарственных средств [5,7].

Богато флавоноидами семейство Ивовых, объединенных в три рода – тополь (PopulusL.), ива (SalixL.) и чозения (ChoseniaNac). На территории России весьма распространен род Ива (более 80 видов), представители которого играют важную роль в формировании растительного покрова, принадлежат к доминирующим ландшафтным видам в местах повышенного увлажнения, а также успешно культивируются [2]. Принято считать, что основное действие коры ивы – противовоспалительное– обусловлено, прежде всего, содержанием в ней салицина, который в ходе метаболизма превращается в салициловую кислоту. Однако, по современным экспериментальным данным, наряду с салицином выраженную фармакологическую активность проявляют и полифенольные соединения [11]. Также экспериментально доказано, что побеги ивы белой проявляют противовоспалительную активность, сопоставимую с корой, несмотря на сравнительно низкое содержание в них салицина [10]. Это свидетельствует, что эффект обеспечивается всем комплексом биологически активных веществ (БАВ), в том числе и флавоноидами, и указывает на необходимость исследований данной группы соединений в различных представителях рода Ива.

За последние годы проводился ряд научных исследований отечественных видов ивы. А.И. Бонцевичем проведен химический анализ коры ивы остролистной (S. acutifoliaWilld.) [1]. О.О. Хитевой изучен химический состав коры и однолетних побегов ивы белой (Salixalba L.), коры ивы трехтычинковой (S. triandra L.) и ивы пурпурной (S. purpurea L.) [10]. Во всех указанных объектах были обнаружены флавоноиды, при этом их содержание оказалось достаточно высоким (например, в коре ивы остролистной- 2,8%, а в побегах ивы белой -1,4%).В связи с этим актуальным является изучение и других отечественных видов ивы с целью расширения сырьевой базы и получения ценного противовоспалительного средства.

Цель работы – обнаружение и количественное определение флавоноидов в коре и побегах ивы вавилонской (Salixbabylonica L.) и ее гидрида с ивой белой (Salixbabylonica х alba L.).

Материал и методы исследования

Объектами исследования являются высушенные и измельченные до размера 1 мм кора и однолетние побеги (ветви длиной до 50 см) ивы вавилонской (Salixbabylonica L.) и ее гибрида с ивой белой (Salixbabylonica х alba L.), собранные в Ставропольском крае в разное время года с 2012 по 2015 г.

Для обнаружения флавоноидов в исследуемых образцах готовили извлечение: 1,0 г сырья заливали 20 мл спирта этилового 70 % и нагревали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут, далее проводили качественные реакции общепринятыми реактивами [3,6,8]. Идентификацию флавоноидов методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) проводили в спиртовых извлечениях в системе растворителей н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2) [3,5]. На хроматографические пластинки «Сорбфил УФ-254» наносили по 30мкл спиртовых извлечений коры, по 20 мкл спиртовых извлечений побегов ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой и по 5 мкл 0,05 % спиртовых растворов стандартных образцов (СО) рутина, геспередина, лютеолина, кверцетина, нарингенина, изосалипурпозида. После хроматографирования пластинки подсушивали и просматривали в видимом и УФ свете. Идентификацию пятен проводили, обрабатывая хроматограммы 5 % спиртовым раствором алюминия хлорида.

Для установления оптимальных условий экстракции использовали различные условия экстрагирования, изменяя вид экстрагента, время экстракции, соотношения сырья и экстрагента, однократную и дробную экстракцию.

Для количественного определения флавоноидов в коре и побегах ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой использовали методику дифференциальной спектрофотометрии, основанную на образовании комплекса с алюминия хлоридом [4].

Валидационные испытания проводили в соответствии с проектом ОФС 42-0113-09 «Валидация аналитических методик» [9].При построении градуировочного графика для определения линейности методикиразличные объемы раствора А (1мл; 2,5 мл; 5мл; 7,5 мл; 10 мл) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, и далее проводили определение как описано в методике количественного определения.При определении правильности использовали метод добавок (5 млраствора Апомещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и добавляли 0.05 % спиртовый раствор СО рутина (0,5; 0,75 и 1 мл), и далее проводили определение как описано в методике количественного определения.

Результаты исследования и их обсуждение

С помощью качественных реакций обнаружили в коре ивы вавилонской и ее гибрида, а также в побегах гибрида флавонолы, флаваноны, флавоны и катехины, а в побегах ивы вавилонской – флавонолы, флаваноны и флавоны. С помощью метода ТСХ удалось идентифицировать в коре и побегах ивы вавилонской рутин, лютеолин, нарингин; в коре гибрида рутин и кверцетин, а в побегах гибрида рутин, кверцетин и нарингин.

При изучении условий экстракции флавоноидов оказалось, что наиболее полное извлечение флавоноидов достигается при соотношении сырья и экстрагента 1:100, использовании в качестве экстрагента спирта этилового 70 % и проведении трехкратной экстракции по 30 мл в течение 30 минут (табл. 1). Наличие в коре и побегах рутина (метод ТСХ) послужило основанием использовать его в качестве стандартного образца при разработке методики. Предварительно было определено, что максимум поглощения комплекса извлечения с 2 % раствором алюминия хлорида находится при 410±3 нм, что совпадает с максимумом поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом (412 нм). Результаты исследования устойчивости окраски комплекса флавоноидов с алюминия хлоридом свидетельствуют о том, что интервал времени, в течение которого происходит образование стабильного комплекса с алюминия хлоридом, составляет 40 минут, а время, при котором раствор стабилен и возможно измерение оптимальных показаний оптической плотности, составляет 80 минут от момента стабилизации окраски.

Таблица 1

Влияние условий экстракции на полноту извлечения суммы флавоноидов из сырья, заготовленного в октябре 2013 года

 

 

Условия экстракции

Содержание, %

Кора ивы вавилонской

Побеги ивы вавилонской

Кора гибрида

Побегигибрида

Экстрагент

 

Однократная экстракция в течение 1 часа при соотношении сырье/экстрагент 1:50

Спирт этиловый 40%

0,143

0,689

0,066

0,799

Спирт этиловый 70%

0,109

0,761

0,078

0,820

Спирт этиловый 95%

0,118

0,540

0.072

0,763

Время экстракции

Однократная экстракция 70% спиртом этиловым

при соотношении сырье/экстрагент 1:50

1 час

0,109

0,761

0,078

0,820

1 час 30 мин

0,107

0,780

0,072

0,862

2 часа

0,110

0,775

0,076

0,878

Соотношение сырья и экстрагента

Однократная экстракция в течение 1 часа

1:50

0,109

0,761

0,078

0,820

1:100

0,121

0,674

0,081

0,760

Кратность экстракции

Экстракция 70% спиртом этиловым

при соотношении сырье/экстрагент 1:100

Однократная экстракция

(60 минут)

0,121

0,674

0,081

0,760

Двукратная экстракция

(50мл по 30минут)

0,152

0,810

0,107

0,910

Трехкратная экстракция (30мл по 30минут)

0,172

 

0,904

0,129

1,136

Для включения данной методики в проект нормативной документации на ЛРС устанавливали ее валидность по критериям специфичность, линейность, правильность, аналитическая область, прецизионность (повторяемость).

Валидационные испытания проводили на извлечениях из побегов ивы вавилонской, собранных в октябре 2013 года в Ставропольском крае.

Критерий специфичность определяли, используя метод добавок. Для этого к извлечению добавляли разные объемы 0,05 % стандартного раствора рутина. Наблюдалось увеличение поглощения при 410 нм пропорционально объему вносимой добавки (табл. 2).

Далее определения критерия линейности определяли уравнение регрессииy = b۰ х + α (х – концентрация определяемого вещества; y – величина отклика; b – угловой коэффициент; α – свободный член). В результате уравнение линейной регрессии имело вид: y = 932,48x + 0,0004, а значение коэффициента корреляцииrсоставило 0,995, что соответствует требованиям ОФС 42-0113-09 «Валидация аналитических методик» 0,99, то есть методика линейна.

Аналитическую область методики устанавливали по диапазону экспериментальных данных, находящихся в пределах от 0,0001255 г/мл до 0,0006479 г/мл.

Правильность методики определяли методом добавок. Рассчитанный критерий Стьюдентасоставил 2,11. Это значит, что выполняется неравенство tвыч.<tтабл(P,f), так как 2,11<4,30 и можно говорить о том, что результаты не отягощены систематической ошибкой, значит методика правильна (табл.2).

Таблица 2

Определение правильности методики спектрофотометрического определения суммы флавоноидов методом добавок

Добавлено

СО рутина

Оптическая плотность

Ах

µ, г

истинное значение

Хi, г

найденное

значение

R, %

Открываемость

Метрологические

характеристики

мл

Г

0

0,5

0,75

1,0

0

0,00025

0,000375

0,00050

0,390

0,649

0,767

0,881

0,00045165

0,00070165

0,00082665

0,00095165

-

0,00070377

0,00083045

0,00095279

-

100,3

100,5

100,1

R = 100,3%

S2 = 0,016

S= 0,126

tвыч.= 3,35

Прецизионность (повторяемость) методики определяли в 6 отдельных навесках сырья. При оценке полученных результатов ориентировались на рекомендации американской ассоциацией аналитической химии (АОАС), в соответствии с которыми показатель RSD не должен превышать 2 %. Результаты, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что показатель RSD составил 1,97 %, т.е. методика прецизионна.

Таблица 3

Результаты определения прецизионности методики определения суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии

Навеска

сырья,

г

Оптическая плотность

Содержание

суммы

флавоноидов, %

2

Метрологические характеристики

1,00100

0,3555

0,8310

-0,0279

0,000778

 

Х = 0,8589%

SD= 0,01691

RSD= 1,97%

1,00700

0,3796

0,8821

-0,0021

0,000004

0,99410

0,3640

0,8568

0,0232

0,000538

1,00810

0,3744

0,8690

0,0101

0,000102

1,00220

0,3678

0,8587

-0,0002

0,00000004

0,99960

0,3657

0,8560

-0,0029

0,000008

Используя разработанную методику, определяли количественное содержание флавоноидов в коре и однолетних побегах изучаемых видов ив, заготовленных в различные сезоныгода(с 2012 года по 2015 год). Полученные данные приведены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты количественного определения суммы флавоноидов в исследуемых образцах сырья, собранных в различныесезоны 2012-2015 г

Наименование

Содержание флавоноидов,%

Сырья

Осень

2012

Весна

2013

Лето

2013

Осень

2013

Весна

2014

Лето

2014

Осень

2014

Весна

2015

Лето

2015

Кора ивы

вавилонской

0,154

0,135

0,172

0,173

0,139

0,215

0,415

0,463

0,314

Побеги ивы

вавилонской

0,740

*

0,904

0,864

*

0,995

1,159

1,419

1,057

Кора гибрида

0,135

0,090

0,129

0,152

0,081

0,138

0,157

0,158

0,139

Побеги гибрида

0,880

*

1,136

0,881

*

1,035

0,748

0,940

0,957

* – в период заготовки сырья листья на ветках отсутствовали.

Как следует из представленных в таблице 4 данных, содержание флавоноидов в коре ивы вавилонской колеблется от 0,14 % до 0,46 % и оно выше, чем в коре гибрида ивы вавилонской и ивы белой (от 0,08 % до 0,16 %). Содержание флавоноидов в побегах ивы вавилонской колеблется от 0,74 % до 1,15 %, в побегах гибрида ивы вавилонской и ивы белой – от 0,75 % до 1,14 %. В побегах ив содержание флавоноидов значительно превышает их содержание в коре. В зависимости от сезона сбора содержание флавоноидов было не постоянным как в коре, так и в побегах. В разные годы сбора также наблюдается изменение в содержании. Тем не менее, полученные данные позволяют установить минимальные пределы содержания флавоноидов при составлении проектов нормативной документации (для побегов ивы не менее 0,7 %, для коры – не менее 0,08 %.

Выводы

1. С помощью метода ТСХ в коре и побегах ивы вавилонской идентифицированы рутин, лютеолин, нарингин; в коре гибрида – рутин и кверцетин, а в побегах гибрида – рутин, кверцетин и нарингин

2. Экспериментально подобраны оптимальные условия методики количественного определения суммы флавоноидов в объектах исследования (соотношение сырья и экстрагента 1:100, использование в качестве экстрагента спирта этилового 70%-ного и проведение трехкратной экстракции по 30 мл в течение 30 минут).

3. Разработанная методика является валидной по критериям специфичность, линейность, правильность, аналитическая область, прецизионность (повторяемость) и может быть использована для количественного определения суммы флавоноидов в коре и однолетних побегах ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой, а также рекомендована для включения в раздел «Числовые показатели» нормативного документа на данный вид лекарственного растительного сырья.

4. В коре ивы вавилонской содержание флавоноидов колеблется в пределах от 0,14 % до 0,46 %; в коре гибрида ивы вавилонской с ивой белой - от 0,08 % до 0,16 %. Содержание флавоноидов в побегах ивы вавилонской колеблется от 0,74 % до 1,15 %, в побегах гибрида ивы вавилонской с ивой белой – от 0,75 % до 1,14 %.

5. Содержание флавоноидов в образцах сырья, заготовленных в 2012-2015гг., не имеет четкой тенденции сезонных колебаний, но полученные данные позволяют установить минимальные пределы содержания флавоноидов при составлении проектов нормативной документации (для побегов ивы не менее 0,7 %, для коры – не менее 0,08 %).

Рецензенты:

Попова О.И., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры фармакогнозии, Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Пятигорск;

Кодониди И.П., д.фарм.н., доцент, профессор кафедры органической химии Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Пятигорск.