Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

MECHANISMS OF OSTEONECROSIS OF THE JAW IN MULTIPLE MYELOMA

Reva I.V. 3, 1, 2, 1, 1 Reva G.V. 1, 3, 1, 2 Tolmachev V.E. 2, 3 Usov V.V. 3 Kalinin O.B. 2, 3 Kalinin I.O. 2, 3 Kim A.R. 2, 3 Bocharov V.S. 2, 3 Danilenko M.V. 1 Yamamoto T.T. 3, 4 Gulkov A.N. 3
1 Engineering school Far Eastern federal university
2 Far Eastern Federal University
3 Biomedicine school Far Eastern federal university
4 International medical education and research center
This paper presents a comparative analysis of the content of immune cells in the lining of dental patients in multiple myeloma and in her absence. The mechanism of osteonecrosis of the jaw authors recognize local changes in mesenchymal-epithelial interactions leading to induced disturbances in the system of specialized and cambium cells, as well as changes in the system of local control effector immune cells barrier properties of epithelial plates mucous membranes and local violations of reparative regeneration of the epithelium and underlying tissues, including jawbone. The authors suggest that local damage cambium cells of the oral mucosa, and changes in the number of immune cells before the first clinical and morphological characters, even ahead of osteonecrosis of the jaw in humans, cause the beginning of a generalized process violations in the system of regulation of differentiation and specialization of stem cells jaw bone. Reparative regeneration is terminated, followed by violation of the specialized support and protection functions of the barrier tissue. The migration of blood stem cells in the zone of alteration leads to the development of secondary immunodeficiency myeloma patients have characteristic of cancer patients with tumors of any localization.
bisphosphonates
reparative regeneration
mucous membrane
antigenpredstavlenie
Langerhans cells
dendritic cells
stem cells
immune cells
the concept of carcinogenesis
carcinogenesis
osteonecrosis
myeloma

Aктуальность. На современном этапе, по данным ВОЗ, успешность имплантации составляет 96-97%, тем не менее, остаются малоизученными вопросы установки имплантов у пациентов, страдающих онкологическими заболеваниями, остеопорозом, у которых на фоне приёма препаратов для специфического лечения развивается серьезный побочный эффект – ассоциированный с бифосфонатами (БТС) остеонекроз челюстей (BRONJ) [1-4]. Несмотря на то, что количество таких больных небольшое, вопросы лечения этой категории пациентов требуют особых подходов при выборе лечения, разработки новой стратегии, фундаментальных представлений о клеточных взаимодействиях, роли иммуноцитов в барьерных свойствах покровных тканей. На современном этапе отсутствуют установки каких-либо стандартов оказания медицинской помощи этой категории больных [11, 23, 27]. Бифосфонаты в основном используется благодаря бесспорным свойствам ингибировать резорбцию кости остеокластами при лечении различных заболеваний, таких как остеопороз, множественная миелома, опухоли, которые метастазируют в кости и злокачественная гиперкальциемия [13, 21].

Применение этих препаратов остро дискутируется, анализируется количество результатов, которые получены in vitro и in vivo в естественных условиях в экспериментах на животных [5, 16].

Существующее положение в стоматологическом менеджменте оказания услуг и помощи больным с онкологией, остеопорозами определило направление наших исследований, посвящённых получению новых данных для четкого понимания механизмов остеонекроза челюстей. Продолжение исследований и разработка практических рекомендаций может привести к новым знаниям в области стоматологии, поэтому изучение механизмов эпителио-мезенхимальных взаимодействий в тканях полости рта является наиболее актуальным [6, 9, 17, 25].

Целью нашего исследования является морфологический анализ материала больных с онкопатологией, в частности, с миеломой, а также остеопорозом для разработки новых данных для дополнений к современной классификации методов хирургического лечения больных на фоне приёма бифосфонатов (BRONJ), и возможности получения прогностической оценки вероятности успеха после установки имплантов.

Материал и методы. Материалом для анализа послужили данные исследований с 2000 года по 2015 год, содержащие сведения о состоянии слизистой оболочки полости рта у больных с онкопатологией, миеломой, остеопорозом, с адентией локальной и генерализованной, врождённой и приобретённой в результате травм в возрасте от 20 до 85 лет, имеющие дефекты зубных рядов с атрофией или без изменений челюстей, удалявших зубы, или утративших зубы в результате кариеса, а также пародонтита или пародонтоза. В качестве контроля исследована СОПР людей без сопутствующей патологии, получивших в результате травмы утрату одного или нескольких зубов. В работе использованы результаты собственных исследований 2-х случаев миеломы с проявлениями остеонекроза и при отсутствии внешних признаков остеонекроза в условиях репаративной регенерации после установки имплантов, а также в период ремиссии миеломной болезни.

Весь спектр клинических обследований слизистой оболочки полости рта проводился в динамике – в процессе подготовки и установки имплантов. Решающим параметром для возможности установки имплантатов являлось наличие достаточного объема кости в области предполагаемой имплантации. Установка внутрикостных имплантатов требует достаточного количества и качества костной ткани в необходимом участке челюсти. При недостатке кости, в зависимости от морфологии дефекта, выбирали метод наращивания гребня. Преимущественно использовали теменные кортикальные костные трансплантаты, подбородочные и взятые с ветви, которые имеют внутримембранное происхождение и потому резорбируются меньше, чем имеющие энхондральные источники развития. Эта особенность репаративной регенерации объясняется быстрой реваскуляризацией и медленной резорбцией костей внутримембранного происхождения.

Все пациенты были условно разделены на группы:

1) согласно возрастной классификации периодизации Г. Крайга: ранняя взрослость – 20–39 лет, средняя взрослость – 40–59 лет, поздняя взрослость – 60 лет и более с учётом сопутствующей патологии и наличием или отсутствием хирургического вмешательства по удалению зубов (табл.1).

Таблица 1

Распределение материала по возрастным группам и патологии

Возраст

Хирургические операции

по удалению постоянных зубов

Онкология, Миелома

Папиллома на СОПР

ССС

Патология

Эндокринная патология

остеопороз

Пародонтит/пародонтоз

были

нет

п/к

диабет

аденома гипофиза

тиреотоксикоз

20-39

23

45/12

0

3

0

3

0

3

0

3/11

40-59

155

9/18

3

5

29

21

3

4

12

4/13

60 и более лет

56

3/6

0

7

63

47

0

0

17

3/59

Контроль

0

36

0

0

0

0

0

0

0

0

ИТОГО

292/36

3

15

92

71

3

7

29

10/83

2) по локализации и характеру дефектов зубных рядов в соответствии с классификацией Е.И. Гаврилова (табл. 2).

Таблица 2

Распределение пациентов по классификации зубных рядов с дефектами

Возраст, лет

Количество наблюдений по классам, абс.

1-й

2-й

3-й

4-й

5-й

6-й

7-й

20–39

8

5

9

8

3

5

4

40–59

9

7

13

11

1

9

5

60 и более

5

17

6

17

4

13

7

Итого

22

29

28

36

8

27

16

4) по характеру и степени атрофии челюстей с частичной или полной адентией в соответствии с классификациями Келлера и Шредера (табл. 3).

Таблица 3

Распределение пациентов по характеру и степени атрофии челюстей с частичной или полной адентией

Возраст, лет

Количество наблюдений по типам, абс.

по Келлеру

по Шредеру

1-й

2-й

3-й

4-й

1-й

2-й

3-й

20–39

4

0

0

0

3

1

0

40–59

1

0

2

1

1

2

1

60 и более

0

1

2

1

0

2

2

5) при планировании дентальной имплантации в соответствии с классификацией М.З. Миргазизова (табл. 4).

Таблица 4

Распределение пациентов по видам дентальной имплантации

Возраст, лет

Кол-во наблюдений по классам (М.З. Миргазизов, 2003)1, абс.

1-й

2-й

3-й

4-й

5-й

6-й

20–39

2

2

4

3

2

3

40–59

4

4

4

14

11

13

60 и более

1

3

2

1

3

2

1 Все классы характеризовались следующими свойствами костной ткани: Q1–2, V1–2, T1–2.

где Q – качество кости (1-4); V – объем кости (1- 4); T– топографические особенности зоны имплантации (1-4).

1 – нормальные параметры (благоприятные условия);

2 – незначительные отклонения, требующие учета без вмешательств);

6) контрольная группа – 36 практически здоровых людей 20–85 лет, утративших зубы в результате травмы, и которым проводилась предимплантационная подготовка полости рта.

При недостатке кости, в зависимости от морфологии дефекта, выбирали метод наращивания гребня. С этой целью использовали методику «золотого стандарта» с аутотрансплантацией костных блоков.

Все пациенты обследованы согласно протоколу с заполнением медицинской карты стоматологического больного формы № 043/у, забор биоптатов производили в рамках Хельсинской декларации с информированного согласия пациентов или, в случае недееспособности, опекунов (2000) и с разрешением этического комитета ФГАОУ ВПО Дальневосточный Федеральный Университет.

Для морфологического исследования при удалении зубов или их корней, имплантации и микрохирургических пародонтологических операций иссекались фрагменты слизистой оболочки десны объемом 1 мм3. Забор материала производился во время хирургического или в ранние сроки после травматического удаления зубов, всего изучено 2879 биопсий. Также материал забирали во время подготовки пациента к установке имплантов (при коррекции атрофии челюстей) и в случае отторжения имплантов (4 случая за период с 2011 по 2015 гг.) для получения полной характеристики взаимодействия эффекторных иммуноцитов в слизистой оболочке полости рта. Параллельно проводился цитологический анализ с поверхности слизистой оболочки полости рта для расширения диагностического ресурса успешности имплантации и прогнозирования исходов и перспектив установки имплантов, а также для разработки мер профилактики осложнений имплантации.

Основным методом морфологического исследования явилось иммуногистохимическое фенотипирование на основе кластеров дифференцировки (Cluster of Differentiation – CD) – T-лимфоцитов (СD4+/СD8+), CD34, клеток Лангерганса (СD68+), интерстициальных макрофагов (СD163+). Интенсивность пролиферативных процессов в эпителиальной пластинке оценивалась по митотическому индексу посредством маркера Ki-67: количество митозов на 100 клеток. Апоптоз изучен Тunel методом для световой микроскопии. Также для изучения апоптических процессов при подготовке полости рта и при имплантации получена характеристика Р53. Иммуноморфологическое исследование проводили в лабораториях патоморфологии и иммунной гистохимии университета г. Ниигата (Япония) и Международном медицинском научно-образовательном центре (IMERC, Ниигата, Япония).

Кроме того, при анализе биопсий использовались рутинные методики (окраски гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, Victoria blue, по Браше и альциановым синим).

Изучение гистологических срезов и мазков-отпечатков осуществлялось с помощью микроскопа Olympus BX52 с оригинальным программным обеспечением для морфометрии.

Статистическая обработка полученных данных, проверка статистической значимости различий между группами по параметрам распределения и сравнение групп выборок проведено с применением методов вариационной статистики, параметрических и непараметрических методов корреляционного анализа.

Результаты собственных исследований. Установлены особенности слизистой оболочки больных миеломной болезнью, пациентов с онкопатологией, а также с остеопорозами, которые заключаются в большем, по сравнению с нормой, количеством апоптозирующих клеток не только в ростковых слоях эпителиальных пластов, но и в собственной пластинке слизистой оболочки полости рта, при этом отмечается сниженная пролиферативная активность кератиноцитов (рис. 1а, 1б, 1в). Также нами отмечена лимфоцитарная инфильтрация.

Рис. 1а-б. Слизистая оболочка десны человека 56 лет при миеломной болезни в зоне установки импланта

Наблюдается апопотоз эпителия в камбиальном и шиповатом слоях, а также в собственной пластинке. А) Апоптозирующие клетки указаны красными стрелками. Лимфоцитарная инфильтрация (указано зелёными стрелками). Микрофото. А-окраска г/э; б) ИГХ (Ki67). Ув.х 400.

Рис. 1в. Диаграмма уровня апоптоза в структурах слизистой оболочки на фоне различной патологии пациентов при имплантации

Методом иммунной гистохимии выявлены отклонения в содержании макрофагов CD68 в слизистой оболочке обследованных больных. Учитывая, что CD68 играет роль в фагоцитарной активности тканевых макрофагов, как во внутриклеточном лизосомальном метаболизме, так и во внеклеточных взаимодействиях клетка-клетка и клетка-патоген, анализ результатов показал, что защитные свойства ткани снижены (рис. 2а). На фоне снижения количества CD68, отмечается многочисленная инфильтрация как эпителиальных пластов, так и прилежащей соединительной ткани эффекторных антигенпрезентирующих иммуноцитов (рис. 2 б, 2в, 2 г).

Рис. 2. Слизистая оболочка десны человека. ИГХ. А) CD68; б, в, г) СD 163.

Микрофото. Ув. 400

При этом нами отмечено, что количество эффекторных клеток CD163 преобладает в собственной пластинке слизистой оболочки десны в зоне имплантации.

Маркёр Р53 позволил выявить клетки преимущественно в базальных камбиальных слоях эпителия (рис. 3), что соответствует данным анализа апоптоза в различных пластинках слизистой оболочки с учётом того, что ядерный белок р53 активируется при повреждениях генетического аппарата, а также при стимулах, которые могут привести к подобным повреждениям, или являются сигналом о неблагоприятном состоянии клетки (стрессовом состоянии). Учитывая отсутствие реституции эпителиоцитов в период острой миеломы, до явных морфологических проявлений, трансформация в клетках связана, скорее всего, с нарушением регуляции синтеза сигнальных межклеточных мессенджеров. Об этом свидетельствует и миграция дендритных антиген представляющих клеток в большей степени из эпителиальных пластинок в подлежащую соединительную ткань. И мы считаем, что данное утверждение, как раз в связи с фактом функции белка р53, которая не проявляется при наличии стволовых клеток, свидетельствует об утрате камбиального регенераторного потенциала с последующим отсутствием дифференцировки и специализации клеток, выполняющих барьерные функции, что и приводит в последующем к нарушению и отсутствию физиологической и репаративной регенерации, сопровождаясь обнажением костной ткани, а затем её некрозом. Данные о том, что в регуляции активности белка р53 ведущая роль принадлежит посттрансляционным модификациям белка и его взаимодействиям с другими белками, объясняют, почему наблюдается уменьшение концентрации свободных рибонуклеотидов, которое, по нашему мнению, происходит потому, что отсутствует свой собственный камбий в эпителиальной пластинке слизистой оболочки. Поэтому этот факт мы считаем как ещё одно косвенное свидетельство уменьшения камбия и отсутствие его пролиферации в период до развития яркой картины разрушения мягких тканей и остеонекроза.

Рис. 3. Слизистая оболочка десны человека. ИГХ. Р53. Микрофото. Ув. 400

Установлено, что высокая активность CD34 проявляется в эндотелии кровеносных сосудов всех калибров, включая мелкие капилляры 5-7 ммк (рис. 4).

Рис. 4. Слизистая оболочка десны человека. ИГХ. CD34. Микрофото. Ув. 400

Так как CD34 является мембранным белком и представлен молекулами межклеточной адгезии, вероятно, опосредованно способен связывать стволовые клетки со стромальными клетками. Служит белковым скаффолдом для присоединения специфичных гликанов, который позволяет стволовым клеткам прикрепляться к лектинам, вырабатываемыми клетками стромы, или связываться с селектинами сосудистого эндотелия.

Обсуждение собственных результатов. Известно, что бисфосфонаты являются первичными агентами в эффективном фармакологическом арсенале против RANKL - остеокласт-опосредованной потери костной массы путем подавления экспрессии генов NFATc1 и Caii при остеопорозе, болезни Педжета, злокачественных новообразованиях с метастазами в кости, мульформной миеломы и гиперкальциемии при злокачественных новообразованиях [7, 10, 15]. Также их назначают при несовершенном остеогенезе и профилактике остеопороза [8]. Однако ограничить патогенез деструкции кости только депрессией остеокластов и снижением ангиогенеза недостаточно, необходимы дальнейшие более глубокие исследования, чтобы патогенетически обоснованно применять бифосфанаты [26]. Структурно-функциональные корреляции, молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе действия бисфосфонатов также рассматриваются в плане поиска новых молекулярных мишеней. Выявленные нами особенности пролиферативной активности кератиноцитов и распределения иммуноцитов в эпителиальной пластинке слизистой оболочки показали, что в патогенезе остеонекроза челюстей на фоне длительного приёма бифосфанатов механизм повреждения ткани челюсти и развития остеонекроза связан не только с влиянием бифосфонатов на активность остеокластов и ингибированием резорбции кости. Наши данные по иммуноцитам согласуются с данными о том, что содержание интерлейкина (ИЛ) -6 и остеопротегерина в слизистой оболочке у пациентов с некрозом были значительно повышены в сравнении с данными у больных без патологии, в то время как концентрация гидроксиметилглутарил кофермента А редуктазы и VEGF значительно уменьшалась [18, 24]. Результаты нашего исследования свидетельствуют о важности мониторинга оценки лечения бисфосфонатами на основе выявления соотношения и распределения количества иммуноцитов в структурах слизистой оболочки, а также производства IL-6, RANKL, остеопротегерина, и VEGF, для того, чтобы выявить начальные микроскопические и биохимические изменения, ведущие к остеонекрозу [19]. Ранняя диагностика может предотвратить или уменьшить заболеваемость вследствие деструктивных поражений костной ткани челюсти [12, 14, 16, 20].

Заключение. Механизм остеонекроза челюстей у стоматологических пациентов с онкопатологией, миеломной болезнью, остеопорозом связан с нарушениями в системе взаимодействия антигенпрезентирующих макрофагов CD68, эффекторных макрофагов CD163, повышенным апоптозом, сниженным регенераторным потенциалом и отсутствием реституции, которая может быть связана с нарушением не только межклеточных эпителио-мезенхимных взаимодествий, но и синтезом сигнальных молекул. Наиболее показательны отклонения в активности клеток, маркирующихся Р53, которые могут служить ярким критерием доклинических проявлений морфологических изменений в системе эпителио-мезенхимных взаимодействий в слизистых оболочках десны в зоне имплантации. Появление большого количества клеток, меченных Р53, свидетельствует о развитии повышенного апоптоза, как отклонения от нормальной физиологической и даже репаративной регенерации, отсутствии реституции, снижении регенераторного потенциала и исчезновении собственных камбиальных кератиноцитов, а также нарушении выработки факторов дифференцировки лимфоцитов вследствие апоптоза эффекторных кератиноцитов. Отсутствие барьерных тканей, ведёт к микробной контаминации костной ткани челюсти и остеонекрозу на фоне нарушения остеосинтеза.

Работа выполнена при поддержке научного фонда ДВФУ, в рамках государственного задания 2014/36 от 03.02.2014 г. и Международного гранта ДВФУ (соглашение № 13-09-0602-м от 6 ноября 2013 г.).

Рецензенты:

Красников Ю.А., д.м.н., профессор школы искусства, культуры и спорта, Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток;

Скляр Л.Ф., д.м.н., доцент ГБУЗ ККБ №2 центр СПИД, г. Владивосток.