В настоящее время во всем мире насчитывается около 347 млн больных сахарным диабетом, при этом около 50% всех больных диабетом приходится на наиболее активный, трудоспособный и репродуктивный возраст 30–59 лет. Еще 20 лет назад численность больных диабетом не превышала 30 млн человек. В 2012 г. около 1,5 млн смертей были непосредственно вызваны сахарным диабетом, которым охвачено более 85% стран. Учитывая темпы роста этого заболевания, эксперты ВОЗ прогнозируют, что количество больных сахарным диабетом к 2030 г. увеличится в 1,5 раза, а сахарный диабет займет 7-е место среди ведущих причин смертности населения [10]. Пациенты с сахарным диабетом часто подвержены таким острым осложнениям, как диабетический кетоацидоз, вызванный накоплением в крови продуктов промежуточного метаболизма жиров (кетоновые тела); гипогликемия, вызванная передозировкой сахароснижающих препаратов и приводящая к гипогликемической коме; гиперосмолярная кома, связанная с сильным обезвоживанием вследствие полиурии; лактацидотическая кома, обусловленная накоплением в крови молочной кислоты. Кроме того, наблюдаются и поздние осложнения: диабетическая ретинопатия, ангиопатия, полинейропатия, нефропатия, артропатия, энцефалопатия и диабетическая стопа. При диабете повышен риск развития психических расстройств, таких как депрессии, тревожные расстройства, расстройства приема пищи [2, 9].
Таким образом, актуальной задачей современной фармацевтической науки остается поиск новых биологически активных соединений с перспективой создания оригинальных отечественных лекарственных препаратов, а также реализации программы импортозамещения. Определенный интерес для данных исследований представляют производные 2,4-диоксобутановых кислот – 5-арил-3-ариламино-3Н-фуран-2-оны, так как способны вступать в реакции дециклизации с NH-нуклеофилами различного строения. Кроме того, возможность введения разного рода заместителей-фармакофоров в фурановый цикл имеет практическое значение в плане дальнейших биологических испытаний.
Для оптимизации фармакологического скрининга и сокращения затрат на лабораторных животных используются различные компьютерные программы, способные прогнозировать возможную биологическую активность. Также широко используются докинговые исследования для оценки возможного взаимодействия химических субстанций с активными сайтами белков рецепторов в сравнении с лекарственными препаратами [7], что позволяет производить целенаправленный синтез биологически активных соединений более эффективно и с минимальными затратами.
Целями настоящего исследования являются анализ потенциальной биологической активности с использованием программы PASS-Online [8], а также практическое изучение гипогликемической активности N-замещенных 5-арил-3-ариламино-3Н-фуран-2-онов (1) и продуктов их взаимодействия (2) с рядом аминов на модели аллоксанового сахарного диабета.
Материалы и методы
Ранее среди производных 2,4-диоксобутановых кислот были обнаружены вещества, обладающие высокой анальгетической, гипогликемической, противовоспалительной, антикоагулянтной и антигипоксической активностью [4, 5]. Для расширения ряда биологически активных соединений решено воспользоваться предварительным планированием их синтеза в ряду N-замещенных амидов 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот (2). Виртуальная библиотека сформирована из соединений, содержащих различные заместители в арильном, ариламинном и гетероциклическом фрагментах:
1: R=H (а), Cl (б).
2: X=NH, R1=C6H5, R2=4-BrC6H4 (а), 4-ClC6H4 (б), 4-NO2C6H4 (в), 4-CH3OC6H4 (г), R1=4-ClC6H4, R2=4-BrC6H4 (д), 4-ClC6H4 (е), 4-NO2C6H4 (ж), 4-CH3OC6H4 (з); X=O, R1=C6H5, R2=4-BrC6H4 (и), 4-ClC6H4 (к), 4-NO2C6H4 (л), 4-CH3OC6H4 (м), R1=4-ClC6H4, R2=4-BrC6H4 (н), 4-ClC6H4 (о), 4-NO2C6H4 (п), 4-CH3OC6H4 (р).
В каждую группу включались соединения, доступные для синтеза известными методами [5]. Результаты исследования приведены в таблице 1.
Острую токсичность определяли на белых нелинейных мышах обоего пола массой 20–22 г с определением LD50 по методу Г.Н. Першина. Соединения вводили перорально в виде взвеси в 2%-ном крахмальном растворе из расчета 0,1 мл/10 г веса однократно. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 2%-ного крахмального раствора. За животными вели наблюдение в течение 14 дней, фиксируя поведение, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координацию движений, тонус скелетной мускулатуры, реакции на тактильные, звуковые и световые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние волосяного и кожного покрова, окраску видимых слизистых оболочек, потребление воды и пищи, изменение массы тела [6].
Гипогликемическую активность изучали на модели аллоксанового сахарного диабета, который моделировали внутрибрюшинным введением аллоксана тригидрата («Alfa Aesar®») в дозе 170 мг/кг [6]. Опыты выполнены на белых нелинейных крысах обоего пола массой 220–260 г. Животных лишали пищи за 16 ч до опыта и на время его проведения. Эксперименту подвергали животных, у которых развивалась острая гипергликемия через 72 ч после введения диабетогена. Исследуемые соединения 1а,б; 2в,г,и-н и субстанцию препарата сравнения – метформина гидрохлорид (ОАО «Фармакон») [3] вводили перорально крысам с аллоксановым сахарным диабетом в дозе 50 мг/кг в виде взвеси в 2%-ном крахмальном растворе. Концентрацию глюкозы в крови животных определяли с помощью глюкометра Сателлит® экспресс (ООО «Компания «ЭЛТА») до введения исследуемых веществ и через 120 мин после начала эксперимента. Результаты представлены в таблице 2 и рисунке 1.
Эксперименты проводились в соответствии с международными этическими и научными стандартами проведения исследований на животных [6]. Достоверность различий между группами оценивали с помощью методов параметрической статистики (t-критерий Стьюдента). Различия между выборками считали значимыми при p ≤ 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Согласно полученным результатам (см. табл. 1) в спектре фармакологической активности изучаемых соединений с наибольшей вероятностью соединения 1а,б будут обладать сахароснижающей, противовирусной и антигельминтной активностью. У соединений 2а-р вероятно проявление противовирусной, антидиабетической активности, а также возможное использование при нарушениях психической деятельности и для лечения диабетической нефропатии. Из побочных эффектов наиболее вероятно проявление судорог и психических расстройств.
Таблица 1
Результаты анализа соединений в системе PASS
Шифр соединения |
Прогнозируемая активность |
Прогнозируемые неблагоприятные эффекты |
1а |
Фибринолитическая, ингибитор гастрина, антигельминтная, активатор инсулина, стимулятор эритропоэза |
Психозы, гематурия, цианоз, депрессия, аллергический дерматит |
1б |
Активатор инсулина, противовирусная (аденовирус), уменьшение раздражения слизистой глаз, антидиабетическая (тип 2) |
Психозы, гематурия, цианоз, депрессия, аллергический дерматит |
2а |
Ретинопротекторная, лечение возрастной дегенерации макулы (желтого пятна), лечение диабетической нефропатии, антидиабетическая (тип 2) |
Судороги, психозы, гипокальцемия, галакторея, мышечная слабость |
2б |
Антиневротическая, активатор кальциевых каналов, активатор инсулина, уменьшение раздражения слизистой глаз |
Судороги, экстрапирамидальное влияние, галакторея, полиорганная недостаточность |
2в |
Активатор инсулина, противовирусная (аденовирус), уменьшение раздражения слизистой глаз, антидиабетическая (тип 2) |
Судороги, психозы, галакторея, цианоз, гипокальцемия |
2г |
Лечение диабетической нефропатии, ингибитор входа вируса, антидиабетическая (тип 2), ингибитор MDM2 (противоопухолевая) |
Судороги, тремор, гипокальцемия, психозы, желудочно-кишечные кровотечения |
2д |
Противовирусная (вирус гриппа), ингибитор ГАМК-трансаминазы, против Helicobacter pylori, лечение диабетической нефропатии |
Судороги, психозы, галакторея, мышечная слабость, потеря веса |
2е |
Активатор инсулина, противовирусная (аденовирус), уменьшение раздражения слизистой глаз, антидиабетическая (тип 2) |
Психозы, гематурия, цианоз, депрессия, аллергический дерматит |
2ж |
Фибринолитическая, ингибитор гастрина, антигельминтная, активатор инсулина, стимулятор эритропоэза |
Психозы, гематурия, цианоз, депрессия, аллергический дерматит |
2з |
Ретинопротекторная, лечение возрастной дегенерации макулы (желтого пятна), лечение диабетической нефропатии, антидиабетическая (тип 2) |
Судороги, психозы, гипокальцемия, галакторея, мышечная слабость |
2и |
Активатор инсулина, противовирусная (аденовирус), уменьшение раздражения слизистой глаз, антидиабетическая (тип 2) |
Судороги, экстрапирамидальное влияние, галакторея, полиорганная недостаточность |
2к |
Антиневротическая, активатор инсулина, активатор кальциевых каналов, уменьшение раздражения слизистой глаз |
Психозы, гематурия, цианоз, депрессия, аллергический дерматит |
2л |
Фибринолитическая, активатор инсулина, ингибитор гастрина, антигельминтная, стимулятор эритропоэза |
Психозы, гематурия, цианоз, депрессия, аллергический дерматит |
2м |
Лечение диабетической нефропатии, антидиабетическая (тип 2), ретинопротекторная, лечение возрастной дегенерации макулы (желтого пятна), |
Судороги, психозы, гипокальцемия, галакторея, мышечная слабость |
2н |
Антиневротическая, активатор инсулина, активатор кальциевых каналов, уменьшение раздражения слизистой глаз |
Судороги, экстрапирамидальное влияние, галакторея, полиорганная недостаточность |
2о |
Противовирусная (аденовирус), уменьшение раздражения слизистой глаз, антидиабетическая (тип 2) |
Психозы, гематурия, цианоз, депрессия, аллергический дерматит |
2п |
Антиневротическая, активатор кальциевых каналов, активатор инсулина, уменьшение раздражения слизистой глаз |
Судороги, экстрапирамидальное влияние, галакторея, полиорганная недостаточность |
2р |
Противовирусная (аденовирус), уменьшение раздражения слизистой глаз, антидиабетическая (тип 2) |
Психозы, гематурия, цианоз, депрессия, аллергический дерматит |
Нами установлено, что изученные соединения обладают высоким профилем безопасности (LD50 > 1350 мг/кг) и ориентировочно могут быть отнесены к четвертому классу опасности (ГОСТ Р 53856-2010) [1]. Общее состояние, внешний вид, реакция на внешние раздражители экспериментальных мышей в течение всего наблюдения являются удовлетворительными и не отличаются от контрольной группы животных. Следует отметить, что токсичность полученных соединений ниже, чем у препарата сравнения – метформина (LD50 = 1250 мг/кг).
Исследование гипогликемической активности показало, что сахароснижающим действием обладает соединение 1б, а вещества 1а, 2г, 2и достоверно повышают уровень сахара в крови экспериментальных животных, что может быть вызвано стимулированием выработки инсулиназы (см. табл. 2 и рис. 1). Выявлено, что в ряду 3-иминофуранонов (1а,б) при введении электроноакцепторного радикала в ароильный заместитель у соединения 1б происходит усиление гипогликемических свойств. Среди продуктов раскрытия 2в,г,и-н отмечено незначительное снижение уровня глюкозы в крови лабораторных животных.
Таблица 2
Гипогликемическая активность соединений
№ |
Уровень глюкозы, ммоль/л |
% торможения гипергликемии через 120 мин |
|
0 мин |
120 мин |
||
1а |
8,7±0,4 |
13,9±0,9 |
-60,1±3,7***1***2 |
1б |
17,7±0,4 |
13,3±0,3 |
25,0±1,5***1***2 |
2в |
15,4±1,2 |
13,4±1,4 |
13,0±4,3***2 |
2г |
16,1±1,7 |
21,3±1,5 |
-31,9±9,3*1***2 |
2и |
8,6±0,5 |
11,2±1,6 |
-30,8±12,2*1**2 |
2к |
26,8±1,4 |
25,7±2,3 |
4,0±11,6**2 |
2л |
17,7±3,5 |
17,2±3,1 |
2,7±13,7*2 |
2м |
13,7±2,4 |
14,1±3,4 |
-3,0±9,5**2 |
2н |
20,7±1,5 |
19±0,5 |
8,4±5,2***2 |
Контроль (алл.д.) |
19,6±0,8 |
19,1±0,9 |
2,6±0,7 |
Метформин |
18,8±0,9 |
9,2±0,8 |
51,8±2,2***1 |
Примечание: *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001; 1 – по сравнению с контролем (аллоксановый сахарный диабет); 2 – по сравнению с метформином
Рис. 1. Гипогликемическая активность исследуемых соединений
Выводы
1. У исследованных производных 2,4-диоксобутановых кислот отмечена более низкая токсичность, чем у препарата сравнения метформина.
2. У продуктов раскрытия 3-иминофуранонов выраженной гипогликемической активности не выявлено.
3. Введение электроноакцепторного заместителя в ароильный фрагмент 3-иминофуранонов приводит к усилению гипогликемических свойств, что делает перспективным их дальнейшее изучение.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 14-03-96016 р_урал_а).
Рецензенты:
Вихарева Е.В., д.фарм.н., профессор, заведующая кафедрой аналитической химии ГБОУ ВПО «Пермской государственной фармацевтической академии», г. Пермь;
Ярыгина Т.И., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры фармацевтической химии ФОО ГБОУ ВПО «Пермской государственной фармацевтической академии», г. Пермь.