Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

COPPERY OXIDASE AND RAPID OXIDATION FE2+ AT AUTOTRANSFUSION BLOOD IS IRRADIATED WITH ULTRAVIOLET LIGHT AN ATHLETES

Eliseev E.V. 1 Deryabin V.M. 2 Dombrovskiy V.I. 2
1 Ural State University of Physical Culture
2 Central Health Part 15 of the Federal Medical-Biological Agency
Исследования экспериментально показали наличие существенных изменений активности супероксиддисмутаза и церулоплазмина у обследуемых в ходе их курсового лечения методом аутотрансфузии ультрафиолетовооблученной крови. Моделируемые при этом методе ультрафиолетовые лучи немедленно подавляют активность церулоплазмина в плазме крови больных и здоровых спортсменов как по отношению к парафенилендиамину, так и к адреналину и норадреналину. Скорость реакции окисления адреналина облученных церулоплазмином ниже, чем у необлученных. Определяя механизмы положительного действия аутотрансфузий крови, облученной ультрафиолетовыми лучами, авторы предлагают рассматривать увеличение активности церулоплазмина как помехоустойчивую реакцию системы крови на возрастающее действие ультрафиолетового излучения.
Experimental studies have shown the presence of significant changes in the activity of superoxide dismutase and ceruloplasmin in subjects during their course of treatment by autotransfusion blood is irradiated with ultraviolet light. Ultraviolet rays inhibit ceruloplasmin activity in the plasma of patients and healthy athletes with respect to both PPD and adrenaline and noradrenaline. The rate of oxidation of adrenaline irradiated ceruloplasmin lower than that of non-irradiated. The authors propose to consider an increase in ceruloplasmin activity as an interference-reaction of the blood to the growing effects of ultraviolet radiation.
ceruloplasmin
superoxide dismutase
lipid peroxidation okisle¬nie
antiradical protection of the blood system
noise immunity

При действии ультрафиолетовых лучей (УФЛ) в биологических системах усиливается образование токсических интермедиатов одноэлектронного восста­новления кислорода, обладающих способностью инициировать и поддерживать реакции неконтролируемого перекисного окисле­ния липидов (ПОЛ).

Ферментная система, инактивирующая свободные радикалы кислорода и тем самым ингибирующая ПОЛ, представлена в клетках (в том числе и в клетках крови) супероксиддисмутазой (СОД) (КФ.1.15.1.1). Фермент осуществляет дисмутацию супероксидных анионов кислорода в Н2О2 и триплетный кислород. В исследованиях [1] СОД-активность обнаружена и в плазме крови, где ее связывают, в частно­сти, с медьсодержащей оксидазой – церулоплазмином (ЦП) (КФ.1.16.3.1). Авторы этой работы предполагают участие этого фермента в детоксикации супероксиданионов во внеклеточных средах, что может существенно расширить положение теории помехоустойчивости организма [2]. Более того, гипотезы о функциях ЦП [3, 6], содержание которого в плазме крови здорового человека очень высоко (около 300 мкг/мл) и с которым связана практически вся медь плазмы (до 98%), позволяют рассматривать его как полифункциональный белок. Отсюда генеральной задачей данной работы явилось изучение влияния церулоплазмина на интенсивность окисления Fe2+ и ряда биологически активных субстратов при аутотрансфузии ультрафиолетовооблученной крови (АУФОК) на активность и содержание ЦП, активность СОД и интенсивность процессов ПОЛ в крови здоровых спортсменов и бывших спортсменов, чья спортивная карьера остановилась после факта выявления врачами у них лимфовенозной недостаточности нижних конечностей.

Объем, материалы и методы исследования

В исследовании приняли участие 67 респондентов. Группу здоровых спортсменов (n=36) составляли кандидаты в мастера и мастера спорта по гандболу и волейболу в возрасте от 19 до 21 года. Данную группу (1-ю группу) мы рассматривали в качестве доноров. В группу бывших спортсменов (2-ю группу) вошли лица (n=31) в возрасте от 25 до 45 лет, спортивная карьера которых остановилась в разное время после факта выявления врачами у них лимфовенозной недостаточности нижних конечностей. По заключению медицинских работников лимфостаз нижних конечностей у респондентов данной группы мог быть спровоцирован целым рядом причин, которые нами не определялись и не анализировались далее в исследованиях. Квалификационный состав данной группы соответствовал реестру спортивной квалификации и видам спорта группы доноров, что позволяло нам в исследованиях сравнивать результаты 1-й и 2-й групп с учетом их относительной и все же максимально возможной (в условиях настоящего исследования) однородности.

Респондентам 2-й группы лечащими врачами были назначены и проводились курсы АУФОК. Использовался аппарат для АУФОК «Изольда» МД-73. Объем облучаемой крови определялся из рас­чета 2 мл на 1 кг массы тела. Доза облучения соответствовала стандартной дозе, рекомендуемой инструкцией к аппарату. Курс АУФОК состоял из 4 сеансов с интервалом 2 суток. Для исследования кровь забиралась из вены до ультрафиолетового облучения (УФО); из аппарата – сразу после УФО и из вены — через 5–10 мин после АУФОК.

Парафенилендиаминооксидазную активность ЦП в плазме крови определяли спектрофотометрическим способом [1]. О содержании ЦП в плазме судили по количеству в ней меди [5]. Интенсивность процессов ПОЛ оценивали по содержанию в плазме диеновых конъюгатов (ДК) липидов, которые определяли спектрофотометрически [1]. СОД-активность измеряли в хлороформ-этанольных (ХЭ) экстрактах плазмы и гемолизированных эритроцитов (Эр) после их трехкратной отмывки физиологическим раствором [4].

Для изучения возможных механизмов влияния УФИ на актив­ность ЦП и СОД использовали кровь респондентов 1-й группы — доноров — и в опытах in vitro проводили облучение цельной крови, плазмы, гемолизированных Эр, ХЭ-экстрактов плазмы и Эр в аппарате «Изольда» МД-73 в течение 1–3 мин, после чего во всех образцах изучали активность ферментов. Кроме того, выделяли ЦП с высокой степенью очистки из плацентарной крови человека [6] и облучали его растворы (25,2 мкмоль/л) в спектрофотометричских кюветах. Через 1, 2, 3 мин измеряли поглощение ЦП в области его характеристических максимумов (при 610 и 330 нм). Одновременно измеряли оксидазную активность ЦП, используя в качестве субстрата окисления раствор парафенилендиамина (0,187 ммоль в 1 л 0,4М Na-ацетатного буфера, рН 5,5), растворы адреналина и норадреналина (0,038–0,38 ммоль в 1 л 0,05 М Na-ацетатного буфера, рН 6,0).

Результаты исследования и их обсуждение. Активность ЦП в крови сразу после I сеанса УФО (в аппарате) достоверно снижалась на 10% и на 15–24% — после II–IV (см. табл.).

Таблица 1

Динамика активности ЦП и СОД, содержание меди и диеновых конъюгатов в крови спортсменов 2 группы во время лечения методом АУФОК ()

Сеанс

Срок на-

блюдений

Церуло-плазмин,

мкмоль/

(л × мин)

Медь плазмы, мкмоль/л

Супероксиддисмутаза, усл. ед.

ДК плазмы, мкмоль/л

плазмы

эритроци-тов

I

1

2

3

3,78+0,15 3,44+0,21* 3,61+0,17

14,4+0,4 13,2+1,2 13,0+0,5

1,9+0,25 1,4+0,24 1,5+0,20

3,6+0,50 3,0+0,50 * 3,7+0,28

10,6 + 1,1

11,3+1,2 10,2+1,2

II

1

2

3

4,12+0,20 3,12+0,19* 3,90+0,28

15,0+0,8 13,3+1,0

14,1 + 1,2

1,8+0,20 1,7+0,25 1,5+0,19

5,5+1,0 5,8+1,0** 4,2+0,57

11,0+1,2 9,9+0,9 9,9+1,3

III

1

2

3

4,34+0,17 3,77±0,19* 3,86+0,33

15,6+0,25 13,0+1,1 14,7+1,9

1,9+0,25 2,1+0,30 2,5+0,10**

6,0+1,0** 6,7+1,50** 5,5+1,60

11,0+0,9 10,7+0,8 10,7+1,4

IV

1

2

3

4,70+0,21** 4,06+0,39 4,31+0,22

16,4+0,8** 14,2+1,8 15,2+0,9

-

-

-

7,0+1,70** 6,7+1,80** 6,1±1,80**

8,4+1,2 7,8+1,3** 6,9+1,6 **

Примечание: * — отличие от исходных показателей при данном сеансе достоверно;

** — отличие от исходных показателей перед I сеансом достоверно (оценка по критерию Вилкоксона—Манна—Уитни, р<0,05); остальные различия недостоверны, где: 1 – до УФО; 2 – сразу после УФО в аппарате «Изольда» МД-73; 3 – через 5–10 мин после АУФОК

Одновременно в плазме снижалось на 11–17% и содержание меди, однако эти изменения не были достоверны из-за большого разброса индивидуальных значений. Через 10 мин после реинфузии облученной крови исследуемые показатели обнаруживали тенденцию к увеличению до исходных значений. В ходе курсо­вого лечения методом АУФОК активность ЦП и содержание меди возрастали и составили ко времени IV сеанса соответственно 125% и 114% от исходных показателей.

Снижение СОД-активности плазмы крови больных во время I и II сеансов АУФОК совпало с динамикой изменения активности ЦП, но носило недостоверный характер (см. табл.). После III сеанса СОД-активность плазмы достоверно увеличивалась на 33% по сравнению с данными до лечения. Активность СОД в Эр перед II сеансом увеличивалась на 53%, а к концу лечения — на 70–94%.

Содержание ДК липидов в плазме крови в ходе каждого сеанса (кроме I) имело тенденцию к снижению по сравнению с их количе­ством до лечения, а после IV сеанса оно достоверно уменьшилось на 29%.

Рис. 1. Влияние УФО растворов очищенного ЦП на скорость реакции окисления адреналина

Примечание: по оси абсцисс – концентрация (С) адреналина, моль/л; по оси ординат – скорость (v) реакции, усл. ед. (график в координатах двойных обратных величин). Растворы ЦП: 1 – необлученные, 2 – облученные

Как показали модельные эксперименты, проведенные на донор­ской крови, ее облучение приводило к немедленному снижению оксидазной активности ЦП на 10–14%, облучение плазмы — к снижению на 20–23%. После УФО растворов очищенного ЦП оксидазная активность фермента ингибировалась на 50% при использовании в качестве субстрата парафенилендиамина или адреналина, и на 20% — при использовании норадреналина, что, видимо, обусловлено различным сродством фермента к этим субстратам. Изучение кинетики окисления адреналина показало (рис. 1), что УФО ЦП приводит к снижению скорости фермен­тативной реакции почти в 1,5 раза при неизменной константе Михаэлиса (Км), равной 0,106 ммоль/л адреналина.

Обсуждение результатов исследования

Проведенные исследования экспериментально показали наличие существенных изменений активности СОД и ЦП у обследуемых 2-й группы в ходе их курсового лечения методом АУФОК. Более того, моделируемые при этом методе УФЛ немедленно подавляют активность ЦП в плазме крови больных и здоровых спортсменов как по отношению к парафенилендиамину, так и к адреналину и норадреналину. Скорость реакции окисления адреналина облученным ЦП почти в 1,5 раза ниже, чем необлученным при неизменной Км. Это обусловлено, по-видимому, тем, что под влиянием УФЛ молекулы ЦП частично переходят восстановленное состояние вследствие конформационных перестроек активного центра. Как известно [3], процесс УФ-инактивации белков начинается с поглощения энергии УФЛ основными хромофорами — триптофаном и цистином, что приводит в итоге к изменению конформации активного центра. В молекуле ЦП обнаружено более высокое содержание триптофана по сравнению с другими белками, и, кроме того, в ней насчитывается до 15 цистиновых групп [6]. Вероятно, эти особенности структуры ЦП и объясняют значительную УФ-чувствительность его молекул.

Возникновение конформационных перестроек в активном центре ЦП при действии УФЛ подтверждается и результатами анализа спектральных характеристик облученного ЦП. Поглоще­ние фермента при 610 нм снижается. Это подтверждается и данными [4], согласно которым выявленная нами интенсивность поглощения обусловлена ионами Cu2+ типа I («голубая» медь), связанными в активном центре с атомами серы цистеина. Более того, согласно нашим предположениям снижение погло­щения происходит как в результате разрыва связи иона меди с серой, так и вследствие восстановления меди. Поглощение облученного ЦП уменьшается и при 330 нм, что также свидетельст­вует о структурных перестройках активного центра данного фермента. Наличие этого поглощения обусловлено ионами диамагнитной меди типа III активного центра ЦП, где они образуют лиганды с тиоловыми группами цистеина и метионина по типу диамагнитных димеров.

Согласно результатам, полученным нами, очевидно, что восстановление меди в молекуле ЦП после УФО имеет большое функциональное значение, поскольку только в восстановленном виде ЦП отдает свою медь клеткам и тканям и только связанная с молекулами ЦП медь используется для синтеза медьсодержащих ферментов и белков. О том, что АУФОК акти­вирует эти процессы, свидетельствует следующая группа фактов: 1) одновременное снижение активности ЦП и содержания меди в плазме крови; 2) увеличение активности СОД в Эр к началу II и последующих сеансов УФО; 3) увеличение активности СОД в Эр после УФО цельной донорской крови при отсутствии эффекта после УФО гемолизированных, предварительно отмытых от плазмы Эр (в условиях отсутствия ЦП). Активирование СОД, по всей вероятности, обусловлено включением элиминированной из ЦП меди в синтез этого фермента. Не исключено, что дополнительный вклад в активирование СОД в Эр цельной крови вносит и индуци­рующий ее синтез кислород, уровень которого в крови заметно увеличивается после АУФОК [1].

Выводы

1. Наблюдаемое в ходе лечения курсом АУФОК активирование ЦП в плазме и СОД в Эр можно считать одним из положительных эффектов приспособления системы крови к УФО.

2. Предложенное и экспериментально обоснованное определение ряда описанных выше реакций может служить примером помехоустойчивой реакцией системы крови к УФО и дополнительно расширить объяснение положительного терапевтического эффекта метода АУФОК.

3. Это позволяет и сам метод АУФОК рассматривать как компенсаторно-приспособительный способ воздействия, направленный на защиту клеток (как извне, так и изнутри) от разрушительного действия супероксиданионных радикалов кислорода и пероксидов липидов, возникновение которых воз­можно при УФО.

Рецензенты:

Байгужин П.А., д.б.н., доцент, профессор кафедры анатомии, физиологии человека и животных ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет», г. Челябинск;

Сабирьянова Е.С., д.м.н., доцент, профессор кафедры «Спортивная медицина и физическая реабилитация» ФГБОУ ВПО «Уральский государственный университет физической культуры», г. Челябинск.