В настоящее время достаточно остро стоит проблема загрязнения почв металлами. Растения и микроорганизмы обладают способностью накапливать и удалять металлы [5, 7, 2]. Наибольший интерес представляют микроорганизмы, в частности бактерии, входящие в состав пробиотиков, поскольку они являются рекордсменами по аккумуляции металлов [6] и обладают рядом полезных свойств, что делает возможным их применение для коррекции функциональных состояний у животных и человека после интоксикации металлами [3]. Влияние металлов на морфологию клетки изучено недостаточно полно [1]. Одним из методов, используемых при исследовании воздействий металлов на клетку, является метод атомно-силовой микроскопии (АСМ). С помощью этого метода и электронной микроскопии можно определить, накапливаются ли металлы на поверхности клетки или поглощаются ею. Использование метода рентгенофлуоресцентного анализа (РФА) позволяет изучить динамику изменения концентрации металлов в среде и клетке.
Цель работы
Установить способность микроорганизмов рода Bacillus накапливать тяжелые металлы и проанализировать их влияние на клетки бактерий.
Материалы и методы
В работе использовались три пробиотических штамма бактерий рода Bacillus: B.пlicheniformis ВКПМ В 7038; B. clausii; B. subtilis УКМ В - 5020. В качестве регулирующих факторов использовались водорастворимые соли металлов ZnSO4*7Н20 - сульфат цинка, Pb(NO3)2 - нитрат свинца, CoSO4*7Н2О - сульфат кобальта, CdSO4*8Н2О - сульфат кадмия, MnSO4*H2O - сульфат марганца и FeSO4*H2O - сульфат железа. Выбор таких элементов, как свинец и кадмий, определялся их большой токсичностью для клетки. Металлы цинк и кобальт выбраны как наиболее распространенные биогенные элементы.
Для определения минимально-подавляющей концентрации (МПК) использовался метод последовательных разведений. Влияние солей тяжелых металлов на рост микроорганизмов определялось по оптической плотности суспензии с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК-КФК-2). Методики выполнения подробно описаны в статье [4].
Динамику накопления металлов клетками исследовали методом рентгенофлуоресцентного анализа (РФА). Микроорганизмы культивировали в жидкой питательной среде в течение 36 ч при 37оC. Каждые 3 ч, начиная с нулевого часа, отбирали суспензию микроорганизмов объемом 3 мл и центрифугировали. Определение проводили в супернатанте. Для анализа выбраны два наиболее токсичных металла (Co, Pb) и один биогенный (Zn). Динамику накопления кадмия измерить не удалось, так как низкие концентрации кадмия в растворе находятся вне диапазона точности измерений прибора. Марганец и железо исключены из исследования, так как слабо накапливаются микроорганизмами рода Bacillus и их влияние на рост незначительно. Анализ динамики накопления металлов произведен на приборе «Spectroscan-LF».
Влияние металлов на морфологию клеток микроорганизмов исследовали с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). Бактерии культивировались в жидкой питательной среде с металлами в течение 36 ч при 37оC, после чего микроорганизмы отмывали. Суспензию микроорганизмов объемом 1 мл центрифугировали в течение 5 мин при 10 000 оборотов. После отбора супернатанта в него добавляли дистиллированную воду до первоначального объема, полученную суспензию тщательно перемешивали. Данную процедуру повторяли 3–4 раза. Это позволило отделить бактерии от среды и металлов, оставшихся в растворе.
С целью определения точной концентрации бактерий, необходимой для нанесения на подложку, предварительно проводили разведения микроорганизмов. Бактерии выращивались без металлов в жидкой питательной среде, затем отмывались. Процедуру проводили 3–4 раза вышеописанным способом. После последнего центрифугирования к осадку в пробирке добавляли 100 мкл дистиллированной воды, увеличивая ее количество на 100 мкл в следующих пробирках, добиваясь разведения 1:1, 1:2, 1:3 и т.д. Наилучшей концентрацией после анализа на АСМ оказалась 1:3. В дальнейшем эта концентрация использовалась для приготовления всех препаратов для проведения экспериментов методом АСМ. Каплю полученной суспензии (30 мкл) наносили на свежий скол слюды и давали высохнуть. В качестве регулирующих факторов выбраны соли свинца как наиболее токсичного и сравнительно сильно аккумулируемого металла.
Полученные образцы сканировались в контактном режиме на атомно-силовом микроскопе СММ-2000 (ОАО «Завод ПРОТОН-МИЭТ», Россия). В работе использовались кантилеверы MSCT-AUNM («Veeco Instruments Inc.», США) микроскопа с жесткостью балки 0,03 Н/м и радиусом кривизны иглы порядка 10 нм. Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа.
Обсуждение результатов
Ранее установлены МПК и влияние металлов на рост микроорганизмов для двух штаммов Bacillus: B. licheniformis 7048 и B. subtilis 7092 [4].
Из результатов, представленных в таблице 1, видно, что металлом, оказывающим наименьшее влияние на рост микроорганизмов, является свинец. Так, B. subtillis УКМ В-5020 растут при концентрации от 0,02 М/л, а B. licheniformis 7038 и B. clausii начинают рост при 0,005 М/л. Наиболее токсичным металлом оказался кадмий. Так, микроорганизмы B. licheniformis 7038 растут при концентрации 3,9∙10-5 М/л, микроорганизмы B. subtillis УКМ В-5020 растут при концентрации 1,5∙10-4 М/л, а Bacillus clausii – при 7,8∙10-5 М/л.
Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, что из всех исследуемых микроорганизмов рода Bacillus самым чувствительным штаммом к используемым металлам является B. clausii.
Таблица 1
Минимально-подавляющие концентрации металлов
|
Исследуемые штаммы |
МПК солей тяжелых металлов, М/л |
|||||
|
Mn |
Pb |
Zn |
Co |
Cd |
Fe |
|
|
B. clausii |
0.0025 |
0.005 |
0.000156 |
0.00125 |
3.91E-05 |
0.00125 |
|
B.licheniformis 7038 |
0.000625 |
0.005 |
0.0025 |
0.00125 |
3.91E-05 |
0.005 |
|
B. subtilis 5020 |
0.000313 |
0.02 |
0.000625 |
0.00125 |
0.000156 |
0.005 |
С помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК) установлено время наступления стационарной фазы при культивировании бактерий без солей металлов. Оно составляет для B. licheniformis 7038 и B.пclausii 27 ч, а для B. subtillis УКМ В-5020 – 24 ч. Наступление стационарной фазы в присутствии солей металлов наблюдается через 27–36 ч культивирования. Для каждого штамма бактерий влияние солей металлов на рост различно. В частности, для B. licheniformis 7038 наступление стационарной фазы в отношении кадмия и цинка происходит через 33 ч культивирования, для кобальта, марганца и железа – через 30 ч, свинец влияния не оказывает. Наступление стационарной фазы для B. clausii в присутствии солей кадмия, кобальта, марганца, железа происходит через 33 ч, цинка – 30 ч, а свинца – 36 ч культивирования. Для B. subtillis УКМ В-5020 стационарная фаза наступает: в отношении кобальта, цинка и свинца через 33 ч культивирования, а в отношении кадмия, марганца и железа – 30 ч.
Анализ данных показывает, что в целом ионы металлов оказывают отрицательное воздействие на микроорганизмы и тормозят наступление стационарной фазы.
Для исследования методом РФА использовался штамм бактерий B. licheniformis 7038. Этот штамм обладает высокой устойчивостью к повышенным концентрациям металлов, в то время как другие штаммы бактерий при аналогичных значениях погибают. Рабочая концентрация металлов выбрана исходя из данных МПК.
Рис. 1. Изменение концентрации металла в супернатанте от времени. Анализ проведен методом РФА. Слева культивирование проводилось с солями свинца, справа — с солями цинка.
По полученным данным РФА (рис. 1) можно сделать вывод, что концентрация металлов в растворе уменьшается с ростом биомассы бактерий. Изменение концентрации кобальта в среде со временем происходит незначительно. Так как данные значения лежат за пределами погрешности прибора, то зафиксировать уменьшение концентрации кобальта не удалось.
Для анализа на АСМ выбран штамм B. licheniformis 7038. На основании ранее полученных данных МПК, РФА, а также с помощью ФЭК выбран только один металл, наиболее аккумулируемый и оказывающий наибольшее влияние на клетки микроорганизмов, – свинец. Концентрация свинца выбрана исходя из полученных данных МПК. Были получены серии изображений опытных и контрольных образцов так, чтобы общее число анализируемых микроорганизмов в каждой группе составляло не менее 30 штук. Далее была изучена морфология клеток, количественные характеристики которой представлены в таблице 2.
Таблица 2
Морфологические характеристики B. licheniformis 7038
|
|
Длина, мкм |
Ширина, мкм |
Высота, нм |
|
Контроль (без Ме) |
3,9445±0,2728 |
2,1592±0,0631 |
512,66±21,1274 |
|
Опыт (с солями Pb) |
3,3005±0,3544 |
1,5596±0,1026 |
538,13±92,5570 |
Результаты, представленные в таблице, указывают на изменение размеров микроорганизмов опытной группы. Так, в присутствии солей свинца происходит уменьшение размеров клеток. Расчет t-критерия Стьюдента показал, что полученное эмпирическое значение находится в зоне значимости (p≤0,01).
Кроме количественных, обращают на себя внимание качественные изменения в опытной группе. Как видно из рисунка 2a2, на бактериях накапливаются частицы, по структуре которых их можно отнести к комплексам металла с органическими молекулами – молекулами среды либо веществами, выделяемыми клеткой в среду. Также на рисунке 2a2 видны структуры, по форме похожие на споры. Они встречаются с частотой 1 структура на 20 обычных клеток микроорганизмов и имеют более округлые формы.
Рис. 2. Фотографии микроорганизмов без металлов и со свинцом. Сканирующая атомно-силовая микроскопия. a1, b1, c1, — без металлов; a2, b2, c2 — в присутствии солей свинца
Вывод
Исследования методами рентгенофлуоресцентного анализа и атомно-силовой микроскопии показали, что бактерии рода Bacillus накапливают металлы. При этом наиболее устойчивым к повышенным концентрациям металлов среди всех исследуемых нами бактерий является штамм B.flicheniformis 7038. Однако локализация накопления металлов до конца не установлена. В случае со свинцом можно лишь судить о значительной его адсорбции на поверхности клетки, но это не исключает аккумуляцию свинца внутри. Для установления локализации накопления других металлов бактериями требуются дополнительные исследования.
Рецензенты:
Барышева Е.С., д.м.н., доцент, заведующая кафедрой биохимии и молекулярной биологии Оренбургского государственного университета, г. Оренбург;
Лебедев С.В., д.б.н., профессор кафедры биотехнологии животного сырья и аквакультуры Оренбургского государственного университета, г. Оренбург.