Имеется ряд работ, посвященных исследованию абсорбции глюкозы из полости тонкого кишечника в норме и патологии [1; 2; 3], в том числе, при сахарном диабете (СД) и его коррекции лекарственными растениями. Так, известно, что вытяжка из алоэ уменьшает всасывание глюкозы при СД, что позволяет снизить уровень сахара в крови экспериментальных животных [8]; экстракт подорожника также способствует снижению гипергликемии при диабете путем ингибирования всасывания глюкозы в кишечнике [9]. Однако какой механизм лежит в основе такого подавления всасывания углевода под влиянием разных фитопрепаратов остается открытым.
Полученные нами ранее данные о гипогликемическом эффекте порошка корневища куркумы (Curcuma longa) [3; 5] позволили высказать предположение, что одним из таких механизмов может явиться ингибирование фитопрепаратом куркумой Na+-глюкозного котранспортера, благодаря чему происходит снижение интенсивности всасывания глюкозы в ЖКТ.
Учитывая вышесказанное, целью работы явилось выяснение особенностей всасывания глюкозы у крыс с аллоксановой моделью СД на фоне приема порошка корневища куркумы и блокады Na+-глюкозного переносчика.
Материал и методы исследования. Для дoстижения поставленной цели были выполнены эксперименты на взрослых самцах крыс линии Wistar: первую серию составляли здоровые животные, находящиеся на стандартном питании (n=25), вторую серию – животные с аллоксан-индуцированным СД (n=31) (рис. 1). В каждой серии были выделены по 2 группы животных: находящиеся на стандартном корме (1 и 3 группы) и получавшие дополнительно порошок корневища куркумы из расчета 2% от массы корма (2 и 4 группы).
Для моделирования аллоксан-индуцированного сахарного диабета живoтным вводили в межлопаточную область 10% раствoр аллоксана из расчета 0,1 мл/100 г массы тела, в то время как здоровым крысам вводили физиологический раствор из того же расчета. Все группы животных находились в стандартных условиях вивария без ограничения потребления воды и пищи.
В течение послеинъекционного периода у всех крыс на 1, 3 и 6 сутки для определения содержания сахара брали пробы крови объемом 0,2 мл путем надсечки хвоста. Концентрацию глюкозы в крови определяли пикриновым методом на спектрофотометре Spekol (Германия) при длине волны 560 нм.
Рис.1. Распределение экспериментальных животных по группам
Исследование интенсивности всасывания глюкозы в кишечнике проводили in vivo путем заполнения 2 мл 30% раствора глюкозы иммобилизованного отрезка тонкой кишки длиной ~ 20 см, при сохранности его иннервации и кровоснабжения. Животные находились под наркозом барбиталом натрия из расчета 0,1 мл/100 г массы тела внутримышечно. Через час после введения раствора глюкозы из тонкой кишки извлекали оставшийся перфузат, в котором определяли концентрацию глюкозы, рассчитывали количество всосавшегося моносахарида, а также % его всасывания (табл.1).
Таблица 1
Формулы для расчета интенсивности всасывания глюкозы
|
Показатель |
Обозначения |
Формула расчета |
Единицы измерения |
|
Концентрация глюкозы |
С |
- |
мкмоль/мл |
|
Объем раствора глюкозы |
V |
- |
мл |
|
Количество введенной глюкозы |
C*Vввед. |
C*Vввед. |
мкмоль |
|
Количество глюкозы в оставшемся перфузате |
C*V ост. |
C*Vост. |
мкмоль |
|
Количество всосавшейся глюкозы |
∆C*V |
C*Vввед.- C*Vост. |
мкмоль |
|
% всасывания глюкозы |
% абсорбции |
(∆C*V / C*Vввед.)*100 |
% |
Для оценки роли Na+-глюкозного котранспортера крысам 2-ой, 3-ей и 4-ой группам за час до опыта вводили per os блокатор «Канаглифлозин» из расчета 0,1 мл/100 г массы тела.
Канаглифлозин (Canagliflozin) – активный ингредиент препарата ИНВОКАНА – имеет химическое название (1S)-1,5-ангидро-1-[3-[[5-(4-фторфенил)-2-тиенил]метил]-4- метилфенил]-D-глюцитола гемигидрат, его молекулярная формула – C24H25FO5S•1/2 H2O, а молекулярная масса составляет 453,53. Канаглифлозин имеет следующую структурную формулу:
Данный блокатор является ингибитором Na+-глюкозного котранспортера 2 типа (SGLT2) и таким образом уменьшает абсорбцию глюкозы в кишечнике и нефроне, повышая ее экскрецию с мочой и калом [7].
Статистический анализ результатов исследования проводили на основе определения средних арифметических (М) и их ошибок (±m). Различия показателей оценивали методами вариационной статистики по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни для независимых выборок и считали достоверными при p≤0,05. Расчеты производили по общепринятым формулам с использованием стандартных программ пакета Statistica 7.0.
Все эксперименты выполняли в соответствии с Международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с использованием животных, принятыми Международным советом научных обществ (CIOMS) в 1985 г., со ст. ХI Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964 г.) и правилами лабораторной практики в РФ (Приказ МЗ РФ от 19.06. 2003, № 267).
Результаты исследования и их обсуждение. Как и в ранее выполненных исследованиях [3; 5], после инъекции аллоксана содержание глюкозы в крови животных уже на 1-е сутки наблюдения было достоверно выше, чем в контроле, что свидетельствовало о развитии сахарного диабета (табл. 2). Однако в течение всего периода наблюдения уровень глюкозы в крови животных 4-ой группы был достоверно ниже по сравнению с аналогичными показателями крыс 3-ей группы, употреблявших стандартный корм, хотя и превышал показатели контрольных животных. Необходимо отметить, что на фоне приема порошка корневища Curcuma longa у интактных животных 2-ой группы уровень сахара в крови на 3 и 6 сутки эксперимента оказался также достоверно ниже аналогичных показателей животных 1-ой группы.
Следовательно, в условиях приема порошка корневища Curcuma longa у контрольных крыс наблюдалось снижение концентрации глюкозы в крови, а у животных с моделью сахарного диабета происходило менее значительное повышение и более быстрая ее нормализация.
Таблица 2
Концентрация глюкозы в крови крыс (ммоль/л) (М±m)
|
Группы животных |
Фоновая проба |
1 сутки |
3 сутки |
6 сутки |
|
Контроль |
4,4 ± 0,34 |
3,6 ± 0,07 |
4,0 ± 0,20 |
4,4 ± 0,07 |
|
Контроль+куркума |
4,0 ± 0,34 |
3,5 ± 0,42 |
2,8 ± 0,25* |
2,2 ± 0,15* |
|
Аллоксан |
5,0 ± 0,12 |
18,3 ± 0,18* |
21,0 ± 0,10* |
16,1 ± 0,30* |
|
Аллоксан+куркума |
4,2 ± 0,30 |
12,2 ± 0,05*∆ |
6,9 ± 0,17*∆ |
5,3 ± 0,15*∆ |
Примечание: в данной и последующих таблицах:
* – достоверные отличия от контрольных крыс (1 группа);
∆ – достоверные отличия между экспериментальными группами.
Одной из причин уменьшения гликемии после приема порошка корневища растения куркумы могло стать снижение интенсивности всасывания углеводов в пищеварительном тракте за счет угнетения Na+-глюкозного котранспортера. Для проверки данной гипотезы была проведена серия экспериментов с перфузией 30% раствором глюкозы мобилизованного отдела тонкой кишки.
Из таблицы 3 видно, что у контрольных крыс процент всасывания глюкозы составил 40,2%, при этом на фоне приема куркумы данный показатель снижался и статистически значимо отличался от 1-ой группы. На фоне СД интенсивность всасывания глюкозы была достоверно выше показателей остальных экспериментальных групп, что может быть обусловлено активацией Na+-глюкозного котранспортера [10]. Необходимо отметить, что в условиях приёма куркумы у крыс 4-ой группы наблюдалось менее значительное всасывание глюкозы. Вероятно, что куркума, также как у здоровых крыс, частично ингибирует активность Na+-глюкозного котранспортера, однако в условиях сахарного диабета у крыс этот эффект проявляется гораздо хуже.
Для проверки выдвинутого предположения об ингибирующем действии куркумы на Na+-глюкозный котранспортер, была проведена серия экспериментов по всасыванию глюкозы в кишечнике крыс на фоне приёма его блокатора – канаглифлозина.
Таблица 3
Всасывание глюкозы в кишке крыс (М±m)
|
Группы животных |
Количество глюкозы во вводимом растворе, мкмоль |
Количество всосавшейся глюкозы, мкмоль |
% всасывания глюкозы |
|
Контроль |
62,5 ± 0,97 |
25,1 ± 2,9 |
40,2 ± 8,8 |
|
Контроль+куркума |
16,0 ± 1,7* |
25,6 ± 7,1* |
|
|
Аллоксан |
57,8 ± 1,7* |
92,5 ± 2,4* |
|
|
Аллоксан+куркума |
53,9 ± 2,4* |
86,2 ± 4,1* |
Примечание: см. табл. 1
Из данных таблицы 4 видно, что после действия блокатора у здоровых животных всасывание глюкозы в кишечнике практически не изменилось (с 40,2±8,8 до 39,2±3,5 %), тогда как на фоне СД данный показатель после действия канаглифлозина существенно снизился – на 60,2%. При сочетанном действии блокатора и порошка растения куркумы процент всасывания глюкозы снизился еще сильнее – на 81,8 %.
Таблица 4
Всасывание глюкозы в кишке крыс на фоне приёма канаглифлозина (М±m)
|
Группы животных
|
Количество глюкозы во вводимом растворе, мкмоль |
Количество всосавшейся глюкозы, мкмоль |
% всасывания глюкозы |
|
Контроль + блокатор |
53,3 |
20,9 ± 1,9
|
39,2 ± 3,5
|
|
Аллоксан + блокатор |
17,2 ± 3,7∆ |
32,3 ± 7,0 Δ |
|
|
Аллоксан+ куркума +блокатор |
5,7 ± 0,7*∆ |
10,7 ± 1,3*Δ |
Примечание: см. табл. 1
Заключение. Таким образом, приём куркумы способствовал снижению процента всасывания глюкозы в кишечнике крыс как в норме, так и при СД. Вероятно, это обусловлено блокадой Na+-глюкозного котранспортера, поскольку при использовании «Канаглифлозина», блокатора Na+-глюкозного котранспортера, происходило аналогичное, но более выраженное ингибирование абсорбции глюкозы, а при сочетанном действии блокатора и куркумы отмечался аддитивный синергичный эффект. Таким образом, это является убедительным свидетельством того, что фитопрепарат обладает умеренным ингибирующим влиянием на транспортные механизмы в кишечнике крыс при различных физиологических и патофизиологических состояниях.
Работа выполнена в рамках государственного задания на оказание услуг (код проекта 3111).
Сахаров А.В., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой зоологии и методики обучения биологии ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный педагогический университет», г. Новосибирск;
Быструшкин С.К., д.б.н., профессор кафедры анатомии, физиологии и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный педагогический университет», г. Новосибирск.