Ель обыкновенная является одним из основных источников деловой древесины. На каждый кубометр древесины приходится до 500 кг отходов, основную часть их (до 250 кг) составляют древесная зелень (охвоенные ветви) и шишки. Отходы лесозаготовки, оставленные на лесосеке, приводят к снижению эффективности использования лесных ресурсов. Древесная зелень и шишки ели обыкновенной содержат достаточно большое количество фармакологически активных веществ [1-3].
Полисахариды растительного происхождения обладают противовоспалительной активностью [9]. Противовоспалительное действие растительных полисахаридов связано с изменением проницаемости сосудистой стенки в очаге воспаления, стимуляцией фагоцитоза, ускорением процессов синтеза, активацией ферментных систем.
Целью нашего исследования является изучение острой токсичности и противовоспалительной активности полисахаридных фракций древесной зелени и шишек ели обыкновенной.
Материалы и методы
Объектами исследования служили образцы древесной зелени и шишек ели обыкновенной. Образцы древесной зелени были собраны в Ильинском районе Пермского края в сентябре 2014 г., образцы шишек — в июле 2014 г.
Полисахаридные фракции выделяли по методу Н.К. Кочеткова [7]. Навеску воздушно-сухого сырья измельчали до размера частиц диаметром 2 мм. Для удаления низкомолекулярных сахаров и фенольных соединений навеску сырья около 100 г предварительно экстрагировали спиртом 80% в соотношении 1:10 в течение 1 ч.
Из шрота после извлечения низкомолекулярных сахаров и фенольных соединений экстрагировали водорастворимый полисахаридный комплекс водой очищенной в соотношении 1:10 при температуре 80°С. Экстракцию повторяли 2 раза в тех же условиях. Объединенные экстракты упаривали под вакуумом и осаждали водорастворимый полисахаридный комплекс трехкратным количеством спирта 96%-ного.
Шрот после выделения водорастворимого полисахаридного комплекса экстрагировали в течение 1 ч смесью 0,25%-ного раствора аммония оксалата и 0,25%-ного раствора щавелевой кислоты (1:1) в соотношении 1:10. Экстракцию повторяли дважды в тех же условиях. Извлечения объединяли, упаривали под вакуумом и осаждали протопектины добавлением четырехкратного количества спирта 96%-ного. Полученные фракции очищали многократным промыванием спиртом 80%-ным.
Определение группового состава углеводного комплекса проводили по методике [8]. Для удаления низкомолекулярных сахаров и фенольных соединений навеску сырья около 10,0 г (точная навеска) предварительно экстрагировали спиртом 80%-ным в соотношении 1:10 в течение 1 ч.
Определение водорастворимого полисахаридного комплекса (ВРПК). Из шрота после спиртовой экстракции ВРПК получали экстрагированием водой очищенной дважды по 100 мл в течение 1 ч. Извлечение фильтровали в мерную колбу вместимостью 200 мл и доводили до метки тем же экстрагентом (раствор А). 2 мл раствора А переносили в центрифужную пробирку, приливали 8 мл спирта 96%-ного и нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения содержимое пробирки центрифугировали в течение 10 мин со скоростью вращения 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок продували в пробирке горячим воздухом до удаления следов этанола. К осадку приливали 4 мл 0,2%-ного раствора антрона в серной кислоте концентрированной, нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Содержимое пробирки после охлаждения переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки спиртом 96%-ным (раствор Б).
Определение пектиновых веществ. Шрот после водной экстракции обрабатывали смесью 0,5%-ных растворов кислоты щавелевой и аммония оксалата (1:1) 3 раза по 80 мл в течение 1,5 ч и далее по схеме определения водорастворимых полисахаридов.
Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре при длинах волн 424 нм (водорастворимые полисахариды), 430 нм (пектиновые вещества) в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 4 мл 0,2%-ного раствора антрона в серной кислоте концентрированной, выдержанной в тех же условиях, что и опытная смесь.
Содержание групп углеводов (Х) в пересчете на арабинозу и абсолютно сухое сырье рассчитывали по формуле:
,
где
А – оптическая плотность исследуемого раствора; kv – коэффициент разбавления (2500 – водорастворимые полисахариды, 5000 – пектиновые вещества); 0,91 – коэффициент гидролиза; Е – коэффициент пересчета на моносахарид (Ara – 67); m – масса навески сырья, г; W – потеря в массе при высушивании сырья, %.
Определение противовоспалительной активности проводили на крысах массой 180–220 г. обоего пола (группа включала 6 животных) на модели острого воспалительного отека, вызванного субплантарным введением в заднюю лапу крысы 0,1 мл 1%-ного водного раствора каррагенина.
Увеличение объема стопы, свидетельствующее о развитии отека, оценивали онкометрически [6] до введения и через 4 ч после введения раствора каррагенина. Исследуемые вещества вводили перорально в дозе 50 мг/кг за 1 ч до введения флогогенного агента. Контролем служили животные, не получавшие препарата. Статистическую обработку проводили по методу Стьюдента.
На основе полученных результатов определяли эффект торможения в процентах к контрольному уровню. О наличии противовоспалительного действия судили по выраженности торможения воспалительной реакции. Если этот показатель был больше 30%, результат учитывался как положительный.
Результаты и обсуждение
Таблица 1
Содержание отдельных фракций полисахаридов в древесной зелени и шишках ели обыкновенной, %
|
Фракция |
Древесная зелень |
Хвоя |
Ветви |
Шишки |
|
ВРПК |
0,70±0,1 |
2,88±0,23 |
0,48±0,18 |
1,51±0,26 |
|
Пектиновые вещества |
3,25±0,18 |
1,99±0,12 |
1,25±0,25 |
0,98±0,11 |
Установлено, что в древесной зелени ели обыкновенной больше содержится пектиновых веществ, а в шишках больше ВРПК. Кроме того, были получены полисахаридные фракции отдельно из хвои и ветвей. Содержание ВРПК в хвое оказалось значительно выше, чем в той же навеске древесной зелени. Содержание пектиновых веществ, наоборот, было меньше, чем в той же навеске древесной зелени. В ветвях наблюдается похожее соотношение по содержанию полисахаридных фракций, что и в древесной зелени.
Таблица 2
Определение острой токсичности полисахаридных фракций ели обыкновенной
|
Фракция |
ЛД50, перорально (мг/кг) |
Класс токсичности |
|
ВРПК шишек |
>5000 |
Малотоксично |
|
Пектиновые вещества шишек |
3250 |
Малотоксично |
|
ВРПК древесной зелени |
>5000 |
Малотоксично |
|
Пектиновые вещества древесной зелени |
815 |
Малотоксично |
Результаты исследования острой токсичности позволяют отнести полисахаридные фракции древесной зелени и шишек ели обыкновенной к классу 4 малотоксичных веществ. ВРПК шишек и древесной зелени обладает гораздо меньшей токсичностью (ЛД50 >5000) по сравнению с пектиновыми веществами, полученными из тех же органов. Самой токсичной оказалась фракция пектиновых веществ древесной зелени (815 мг/кг).
Таблица 3
Противовоспалительная активность полисахаридных фракций ели обыкновенной
|
Фракция |
% прироста стопы через 4 ч |
% торможения через 4 ч |
|
ВРПК шишек |
37,6±12,9 р<0,001 |
65 |
|
ВРПК древесной зелени |
49,7±9,9 р<0,001 |
54,6 |
|
Пектиновые вещества шишек |
55,3±4,9 р<0,001 |
49,5 |
|
Пектиновые вещества древесной зелени |
52,3±11,5 р<0,001 |
52,2 |
|
Контроль |
109,5±4,7 |
|
р – достоверность в сравнении с контролем
Данные таблицы 2 демонстрируют достаточно высокий уровень противовоспалительной активности фракций комплекса полисахаридов древесной зелени и шишек ели обыкновенной.
Самой активной фракцией оказалась фракция ВРПК шишек, процент торможения 65%. ВРПК древесной зелени тормозит образование отека в сравнении с контролем на 54,6%. Пектиновые вещества древесной зелени и шишек оказались менее активными.
Рис. 1. Процент прироста стопы
На диаграмме видно, что на фоне введения полисахаридных фракций прирост стопы, вызванный субплантарным введением в заднюю лапу крысы 0,1 мл 1%-ного водного раствора каррагенина, через 4 ч значительно уменьшается по сравнению с контролем. Торможение отека составляет 49,5–65% в зависимости от фракции.
Учитывая, что ВРПК шишек и древесной зелени отнесен к классу малотоксичных веществ, возможно применение данной фракции в качестве противовоспалительного средства при практически отсутствующем вреде для организма.
Заключение
1. В результате изучения содержания полисахаридных фракций установлено, что в древесной зелени ели обыкновенной содержится больше пектиновых веществ, а в шишках выше содержание водорастворимого полисахаридного комплекса.
2. Установлено что водорастворимый полисахаридный комплекс древесной зелени и шишек ели обыкновенной является менее токсичным ЛД50 >5000 мг/кг, чем пектиновые вещества.
3. Установлено, что самой активной фракцией, проявляющей противовоспалительный эффект, является ВРПК шишек (торможение отека 65%). Остальные фракции показали активность с процентом торможения около 50%.
Рецензенты:Солонинина А.В., д.фарм.н., профессор, заведующая кафедрой УЭФ, ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Пермь;
Хомов Ю.А., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической химии ФДПО и ФЗО, ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Пермь.