Цель исследования
Исследование лекарственной безопасности и спектра психофармакологической активности субстанции 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина.
Материалы и методы исследования
Синтез 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина был осуществлен путем алкилирования аденина-основания 1-бром-2-(4-изопропилфенокси)этаном в среде безводного диметилформамида в присутствии избытка карбоната калия при температуре 105-110 °С. Исследование лекарственной безопасности (острой, подострой, хронической токсичности, кумулирующего действия, мутагенности, аллергенности, иммунотоксичности, влияния на репродуктивную функцию и половое поведение животных) 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина проводили в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [12].
1-Бром-2-(4-изопропилфенокси)этан. Смесь 15,0 г (0,110 моль) 4-изопропилфенола, 20,0 мл (0,232 моль) 1,2-дибромэтана и раствора 6,2 г (0,110 моль) КОН в 10 мл воды кипятят в течение 8 ч до нейтральной реакции. Реакционную массу разбавляют 100 мл хлороформа, органический слой промывают 3%-ным раствором натрия гидроксида (50 мл) и водой (2 × 50 мл) до нейтральной реакции, сушат сульфатом натрия, фильтруют, растворитель и избыток 1,2-дибромэтана отгоняют в вакууме водоструйного насоса на кипящей водяной бане. Остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию, кипящую при 158-162 °С (3 мм рт. ст.). Получают 13,5 г бесцветной прозрачной жидкости, n20D 1,5118, выход 51%.
9-[2-(4-Изопропилфенокси)этил]аденин. Суспензию 5,0 г (0,037 моль) аденина и 6,3 г (0,045 моль) свежепрокаленного карбоната калия в 50 мл безводного ДМФА перемешивают при температуре 105-110 °С в течение 30 мин, добавляют раствор 9,0 г (0,037 моль) 1-бром-2-(4-изопропилфенокси)этана в 25 мл ДМФА и перемешивают при той же температуре в течение 2 ч. Горячую реакционную массу фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме, остаток растирают с 50 мл холодной воды и выдерживают при температуре 0-5 °С в течение суток. Образовавшийся осадок отфильтровывают, сушат на воздухе и перекристаллизовывают из смеси 100 мл ДМФА и 10 мл воды. Получают 6,1 г светло-желтого кристаллического вещества, выход 55%. Rf 0,64 (Silufol UV-254, метиленхлорид - метанол, 10 : 1). Т. пл. 231-233 °С. Масс-спектр: М+ 297 (6%), 282 (2%), 254 (2%), 178 (9%), 163 (81%), 149 (84%), 134 (100%), 119 (30%), 107 (50%), 105 (47%), 92 (99%), 91 (80%). Спектр ЯМР 1Н (ДМСО-D6), δ, м. д.: 1,24 д (7 Гц, 6 Н, СН3); 3,02 м (7 Гц, 1 Н, СН); 3,98-4,16 м (4 Н, СН2СН2); 6,62 уш. с (2 Н, NH2); 6,70-7,14 м (4 Н, С6Н4); 8,04 с (1 Н, Н8); 8,12 с (1 Н, Н2).
Результаты исследования и их обсуждение
Изучение острой токсичности 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина показало, что в токсикологическом плане этот ароматический аналог пуринового нуклеозида аденозина является безопасным. Величина ЛД50 субстанции 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина при внутрижелудочном введении половозрелым животным составляет: 992 мг/кг у мышей самок и 1035 мг/кг - у мышей самцов; 4812 мг/кг - у крыс самок и самцов. ЛД50 субстанции 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина при внутрибрюшинном введении половозрелым животным составляет: 943 мг/кг у мышей самок и 963 мг/кг - у мышей самцов; 3958 мг/кг - у крыс самок и самцов. С учетом классификации токсичности веществ по И.В. Саноцкому субстанция 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина может быть отнесена к классу малотоксичных веществ.
Проведено исследование подострой токсичности субстанции 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина. Субстанцию вводили внутрижелудочно в течение одного месяца в дозах 10 мг/кг (терапевтическая доза), 75 мг/кг (превышающая терапевтическую в 7,5 раз), 150 (превышающая терапевтическую в 15 раз) и 300 мг/кг (токсическая доза). Наблюдения за животными вели в течение 2 месяцев, то есть в период введения субстанции и одного месяца после её отмены. Установлено, что изучаемая субстанция при месячном введении крысам в дозах 10 и 75 мг/кг не приводит к изменениям в общем состоянии животных. При этом отмечено, что прирост массы тела животных был положительным и значимо с контролем не различался. По результатам электрокардиографических, гематологических и биохимических исследований патологических изменений не зафиксировано. Выявленные сдвиги в данных исследованиях не выходили за рамки физиологических норм и восстанавливались до уровня контрольных значений в течение месяца после отмены введения соединения. У животных, получавших субстанцию в дозе 300 мг/кг, снижение прироста массы тела было достоверно ниже. В дальнейшем было показано, что у крыс, получавших испытуемую субстанцию в дозе 300 мг/кг, обратимо активируется выброс в периферическую кровь эритроцитов, которые существенно снижаются после отмены введения данного вещества. Функциональными исследованиями показано обратимое, но достоверное увеличение продолжительности «гексеналового сна» у крыс, получавших испытуемую субстанцию в дозе 300 мг/кг, и снижение реабсорбирующей и экскреторной активности почек, что, вероятно, может свидетельствовать о действии субстанции на данные органы, как «мишень». Гибели животных в этой группе не наблюдалось, патоморфологическими исследованиями показано мишенеобразное действие вещества в дозе 300 мг/кг на печень и почки.
Выполнено изучение хронической токсичности субстанции 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина. Субстанцию вводили самкам и самцам крыс внутрижелудочно в течение 3 месяцев в дозах 10, 75 и 150 мг/кг. Установлено, что при 3-месячном введении крысам в дозах 10 и 75 мг/кг субстанция не приводит к изменениям в общем состоянии крыс. При этом отмечено, что прирост массы тела животных был положительным и значимо с контролем не различался. По результатам электрокардиографических, гематологических и биохимических исследований патологических изменений не зафиксировано. Выявленные сдвиги в данных исследованиях не выходили за рамки физиологических норм. В дозе 150 мг/кг субстанция не влияет на общее состояние животных, но способствует обратимому снижению прироста массы тела. Таким образом, на основании проведённых исследований можно заключить, что вещество при внутрижелудочном введении крысам в дозах 10, 75 и 150 мг/кг не оказывает патологического действия на основные гомеостатические константы, то есть является безопасным.
Показано отсутствие у субстанции 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина гонадотоксического, эмбрио- и фетотоксического действия, регистрируемых в антенатальном и постнатальном периодах развития. Вещество не обладает аллергенными, мутагенными и иммунотоксическими свойствами.
При изучении специфической нейропсихотропной активности установлено, что 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденин на различных моделях депрессии и стресса: хемоиндуцированная модель депрессии «резерпиновая депрессия», стрессиндуцированная модель депрессии «выученная беспомощность» (вызванная хроническим стрессом), тест «принудительное неизбегаемое плавание» по Порсолту, тест «потребления/предпочтения сахарозы», тест отчаяния (вынужденное плавание в сосуде со свободновращающимся колесом) - проявляет выраженную антидепрессивную и стресспротекторную активность. По выраженности антидепрессивного действия соединение превосходит мелипрамин, циталопрам и мапротилин, сопоставимо с флуоксетином, сертралином, уступает пароксетину и венлафаксину. Соединение положительно влияет на психоэмоциональный статус крыс на модели «зоосоциального взаимодействия», превосходит препараты сравнения имипрамин и циталопрам в сопоставимых дозах. В условиях естественного старения и алкогольно-токсического поражения головного мозга на различных моделях депрессивных состояний 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденин уменьшает выраженность депрессивных и эмоциональных нарушений, превосходит по антидепрессивной активности имипрамин и циталопрам в сопоставимых дозах. Соединение существенно ослабляет выраженность депрессивных эффектов резерпина (гипотермия, каталепсия и блефароптоз) и выраженность гипотермии, каталепсии и блефароптоза, вызванных фенотиазиновым нейролептиком левомепромазином. На модели ишемического инсульта у крыс 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденин (10 мг/кг в сутки) оказывает нейропротекторное действие, превосходя препарат сравнения мексидол в аналогичной дозе в отношении уменьшения неврологического дефицита, а также не уступает ему в дозе 25 мг/кг в сутки по влиянию на данный показатель и летальность. Механизм действия соединения связан со стимуляцией дофамин- и серотонинергической нейропередачи, предположительно опосредованной антагонистическим взаимодействием с глутаматными NMDA-рецепторами.
Заключение
В результате проведенных исследований доказаны высокая эффективность и безопасность субстанции 9-[2-(4-изопропилфенокси)этил]аденина. Разрабатываемое на его основе лекарственное средство может обеспечить эффективное лечение пациентов с депрессивными расстройствами, являющимися частой причиной заболеваемости и преждевременной смертности трудоспособного населения.
Исследования выполнены в рамках государственного контракта от 13 сентября 2011 г. № 11411.1008700.13.077 с Минпромторгом России.
Рецензенты:
Симонян А.В., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической технологии и биотехнологии ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Волгоград;
Сысуев Б.Б., д.фарм.н., доцент, заведующий научно-производственной лабораторией ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр» Администрации Волгоградской области, г. Волгоград.