Современный этап развития науки характеризуется высоким темпом роста нанотехнологий с использованием веществ и материалов размером от нескольких десятков до сотен нанометров. Правительством Российской Федерации были утверждены (распоряжение от 7 июля 2011г № 1192-р) требования к продуктам наноиндустрии в случае соответствия их параметрам составляющих характеристик и размеров, хотя бы в одном измерении находящихся в пределах от 1 до 100 нанометров (верхний предел определяется размерами белков, ДНК, биологических молекул и иных органических соединений). Одной из таких сфер применения нанотехнологической продукции и является создание медицинских препаратов, предназначенных для диагностики и лечения ревматических заболеваний.
Ревматические заболевания представляют собой хронический вялотекущий процесс, для которых характерно большое разнообразие форм и вариабельность темпов прогрессирования. Важное место среди них занимает системная красная волчанка (СКВ). Наиболее частой причиной летальности и развития стойкой нетрудоспособности при данной патологии являются Lupus-нефрит и Lupus-ЦНС, сопровождающиеся множественными поражениями внутренних органов. Так, антитела к нативной ДНК и фосфолипидным антигенам обуславливают развитие соответственно волчаночного гломерулонефрита и антифосфолипидного синдрома (АФС), включающего рецидивирующие артериальные и венозные тромбозы, эмболии, поражение центральной нервной системы, акушерскую патологию. Данные проявления часто выходят на ведущее место в клинической картине заболевания, определяя его тяжесть и неблагоприятный прогноз. Так, антитела к кардиолипину обуславливают развитие субтипа системной волчанки с признаками АФС, при котором часто невозможно подавить активность заболевания традиционными средствами базисной терапии, в связи с чем и возникает необходимость изучения этих патогенетических иммунологических процессов. Обнаружение в сыворотке крови различных аутоантител может иметь большое диагностическое значение. Кроме того, такие антитела обладают значительным патогенным действием, и их удаление из организма оказывает благоприятное лечебное воздействие на течение основного заболевания [6].
На основе интеграции антигенных нанообъектов, нами были созданы и апробированы иммобилизированные магнитоуправляемые антигенные наносистемы (АНС). Они представляют собой полиакриламидные гранулы с включенным в их структуру антигеном.
Нанообъектами мы называем химические группы, которые формируют активные центры ферментов, антигенные детерминанты, клеточные рецепторы и т д. Наиболее интересным в этом отношении нам представляется, как модель, антигенный препарат - кардиолипин.
Кардиолипин - фосфолипид, структурный компонент внутренней мембраны клетки и митохондрий, построенный на основе глицерола и остатков фосфатидной кислоты. Кардиолипин может обладать антигенными свойствами, они заключены в гидрофильной части молекулы, а не в гидрофобной его части.
Формула кардиолипина С81-Н152-О17-Р2. Схема его структурной формулы может быть представлена в виде параллелепипеда. Учитывая длины связей С-С - 0,154 нм; C=C - 0,133нм; С-Н - 0,112; С=О - 0,123 нм (Н.А. Тюкавкина, Ю.И. Баюков, 1985) можно примерно вычислить объем молекулы кардиолипина, представленной по первичной структуре, размер которого V = а х в х с, V = 2,772 х 0,154 х 1,034 = 0,4414 нм3 , что соответствует определению нанообъектов как частиц размерами менее 100 нм [8].
Для получения стабильных иммобилизированных биопрепаратов многократного применения с заданными свойствами (формой, диаметром частиц, размером пор, плотностью), мы использовали метод эмульсионной полимеризации в наших модификациях с использованием полиакриламидного геля в качестве носителя. Данный метод позволил существенно увеличить сорбционную емкость, сохранить антиген в максимально нативном состоянии и открыл возможности контролируемого модифицирования нанообъектов [1].
Целью нашей работы являлось изучение влияния метода эмульсионной полимеризации на активные центры антигенных детерминант кардиолипина при АФС у больных системной красной волчанкой.
Методика исследования
Существует несколько методических подходов для использования кардиолипина в качестве антигена в иммунологических реакциях, от хаотичной иммобилизации до пространственно-ориентированной.
Один из способов включения кардиолипинового антигена на основе иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов (ИГАП) заключается в том, что предварительно полученные, высушенные, обезвоженные полиакриламидные гранулы с включенными ферромагнитными материалами помещали в спиртовой раствор кардиолипинового антигена. После инкубации, полученные гранулы приобретали шаровидную форму, и они переносились в гидрофильную фазу.
Полученный, таким образом, кардиолипиновый антиген находился в свободном состоянии и его фиксация в гранулах была только за счет электростатических Вандервальсовских сил и т.п. Концентрацию антигена (липидов) определяли по Лазарову (табл.1) [7].
Таблица 1
Потери кардиолипина при I способе иммобилизации
Концентрация кардиолипина в растворе, мг |
Иммобилизированный кардиолипин, мг М±m |
Потери кардиолипина М±m |
Эффективность иммобилизации % |
28 |
10,6±0,68 |
17,4±0,68 |
37,8% |
24 |
8,8±0,83 |
15,2±0,37 |
36,1% |
20 |
8,8±0,84 |
11,2±0,84 |
44% |
16 |
6,6±0,89 |
9,4±0,89 |
41,3% |
12 |
3,8±0,84 |
8,2±0,84 |
31,6% |
Существует еще один из способов получения кардиолипинового иммуносорбента путем связывания полиакриламидного носителя с антигеном, смешанным с раствором полиметилметакрилата в хлороформе в соотношении 1: 1 и выделения целевого продукта, отличающейся тем, что в качестве носителя используют гранулированный полиакриламидный гель с концентрацией поперечносшивающего агента 25% и с включением в него 10%-ным оксидом железа [2,3]. Концентрированный кардиолипиновый антиген получали из коммерческого препарата «Кардиолипиновый антиген для реакции микропреципитации». Три ампулы по 2 мл раствора кардиолипина в абсолютном этаноле концентрировали до полного испарения в термостате при 37Со в течение 48ч Приготовленный концентрированный кардиолипиновый антиген в количестве 28 мг вносили в 2 мл 0,5%-ного раствора полиметилметакрилата в хлороформе, доводя концентрацию липидов до 14 мг/мл, т.е., по сравнению с исходной концентрацией, произошло концентрирование липидов в три раза. Полученный раствор смешивали с полиакриламидными гранулами в соотношении 1:1. Суспензию инкубировали в течение 3 ч. на магнитной мешалке в термостате при 37Со. После инкубации, пропитанные в растворе антигена полиакриламидные гранулы вносили в 10 мл воды и энергично встряхивали для получения эмульсии вода/хлороформ. В пробирку с суспензией подавали газообразный азот под давлением 0,5 атм. по трубке с сечением 0,5 мм, таким образом, чтобы создать интенсивное перемешивание в течение 15 мин. Пробирку постепенно нагревали на водяной бане до температуры кипения хлороформа (60 Со) до его полного испарения. После исчезновения запаха хлороформа в растворе определялась концентрация несвязанных липидов, которая составила 5 мг/мл, т.е. в носитель включалось 23 мг кардиолипина (табл 2).
Таблица 2
Потери кардиолипина при II способе иммобилизаци
Концентрация кардиолипина в растворе, мг |
Иммобилизированный кардиолипин, мг М±m |
Потери кардиолипина М±m |
Эффективность иммобилизации % |
28 |
23,6±0,63 |
4,4±0,67 |
84,2% |
24 |
20,6±0,83 |
3,4±0,78 |
85,8% |
20 |
17,4±0,68 |
2,6±0,86 |
87,1% |
16 |
13,6±0,69 |
2,4±0,83 |
85% |
12 |
10,2±0,67 |
1,8±0,86 |
85% |
Полученные гранулы при постановке иммунологических реакций (иммуноферментный) в процессе отмывки, применения детергентов приводило к некоторым потерям кардиолипинового антигена, за счет чего и снижалась чувствительность этих примененных методов.
Используя различия гидрофобных и гидрофильных частей молекулы кардиолипина и новый метод иммобилизации с использованием полиакриламидного геля в качестве носителя, можно получать стабильные, пространственно-ориентированные, гранулированные с магнитными свойствами нанообъекты, с последующим применением их в диагностике и лечении больных ревматическими заболеваниями [4,5,6, 9, 10].
Учитывая это, в дальнейшей своей работе мы остановились именно на II способе включения антигенов в магнитные гранулы.
Результаты исследования и обсуждение
По описанной выше методике была произведена сорбция антикардиолипиновых антител из плазмы крови больных СКВ с клиническими проявлениями антифосфолипидного синдрома. В качестве контроля использовались сыворотки крови 10 практически здоровых лиц. Уровень антител к кардиолипину определяли до и после сорбции непрямым твердофазным иммуноферментным методом. В элюате измеряли концентрацию общего белка по Лоури. Полученные результаты представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, после сорбции на полученном II способом сорбенте происходило достоверное снижение концентрации антител до уровня здоровых лиц. Использование же I способа получения сорбента также сопровождалось достоверным снижением концентрации антител ( р ≤ 0,001) по сравнению с исходным уровнем до сорбции, однако показатели не достигали уровня концентрации таковых у доноров и превышали их почти в два раза, что легко объяснить двукратным различием в сорбционной емкости предлагаемого иммуносорбента по сравнению с сорбентом, полученным I способом.
Таблица 3
Сорбция антител к кардиолипиновому антигену из плазмы крови СКВ.
Метод получения сорбента |
Концентрация АТ к КЛ до сорбции, е.о.п. М±m |
Концентрация АТ к КЛ после сорбции, е.о.п. М±m |
Сорбционная емкость мг/мл |
II способ I способ |
0,328±0,0289 0,328±0,0289 |
0,059±0,0170 0,119±0,0331 |
8,00±0,390 3,90±0,331 |
р |
|
0,014 |
|
Контроль специфичности сорбента определяли путем смешивания 1 г гранул с 4 мл сыворотки крови донора на магнитной мешалке с интервалом 15 мин, в ней определяли концентрацию белка по Лоури, иммуноглобулинов по Манчини классов G,А,М. Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4
Контроль специфичности сорбента
Время |
Общий белок мг/мл |
IgG мг/мл |
IgA мг/мл |
IgM мг/мл |
Исходный фон 15 30 45 60 |
73 75 72 71 75 |
10,5 11,8 9,90 10,9 11,9 |
1,3 1,2 1,36 1,28 1,27 |
1,25 1,25 1,25 1,04 1,02 |
Нами был проведен сравнительный анализ классического ИФА и ИФА с использованием иммобилизированных гранулированных препаратов, полученных II способом. Использование иммобилизированного гранулированного кардиолипина в предложенном нами варианте ИФА и раствора кардиолипина в традиционном твердофазном ИФА для фосфолипидов показало, что максимальное значение экстинции с одинаковым рабочим разведением пула сывороток было 0,280±0,033 мг в классическом варианте и 0,342±0,027 мг в нашей модификации. Минимальные положительные значения экстинции в традиционном методе соответствовали разведению пула сывороток 1÷800, а с использованием иммобилизированных препаратов -1÷6400. Применение иммобилизированной формы кардиолипина в предлагаемом методе позволило увеличить чувствительность ИФА в 8 раз по сравнению с традиционным методом на полистероловых планшетах.
Заключение
Метод эмульсионной полимеризации с учетом гидрофобных и гидрофильных свойств молекул липидов позволяет контролируемым образом получать и модифицировать биомолекулы с характерными свойствами. Этот метод дает возможность придать химическим группам нанообъектов, входящим в активные центры ферментов антигенных детерминант, клеточных рецепторов и токсинов, принципиально новые качества и осуществляет их интеграцию в полноценно функционирующие системы большего масштаба, коими и являются иммобилизированные гранулированные антигенные препараты (ИГАП). Поэтому такие биологические структуры можно считать полноценными нанообъектами, а используя методы иммобилизации, осуществлять их практическое применение в биотехнологии, иммунологии, ревматологии.
Рецензенты:Грехов Р.А., д.м.н., зав. лабораторией клинической психологии ФГБУ «НИИ КиЭР» РАМН, г. Волгоград;
Мартемьянов В.Ф., д.м.н., профессор, зав. клинико-биохимической лабораторией ФГБУ «НИИ КиЭР» РАМН, г. Волгоград.