Цель работы: изучить в сравнительном аспекте липидрегулирующий эффект эмоксипина, реамберина и верапамила в предупреждении липидных дестабилизаций при остром панкреатите при их превентивном применении.
Материалы и методы исследования
Основой работы явились экспериментальные исследования на 40 взрослых беспородных собаках обоего пола массой от 5,9 до 14,1 кг, разделенных на следующие группы: первая группа (n=8) - контрольная; вторая группа (n=8) - опытная (с эмоксипином), третья группа (n=8) - опытная (с реамберином), четвертая группа (n=8) - опытная (с верапамилом). Для получения данных, принятых за норму, произведены исследования у 8 здоровых животных.
Острый панкреатит моделировали по способу В.М. Буянова с соавт. (1989). Взрослым беспородным собакам выполняли срединную лапаротомию, проводили пункцию желчного пузыря с забором желчи и последующим лигированием места пункции. Далее желчь вводили в паренхиму вертикальной части поджелудочной железы по 0,5 мл в 8 точках. Таким образом воспроизводили деструктивную форму острого панкреатита. В опытных группах оценивали ряд фармакодинамических эффектов препаратов: эмоксипина (ежедневные внутривенные введения 1 % раствора (10 мг/кг)), реамберина (ежедневные внутривенные введения в дозе 15 мл/кг), верапамила (ежедневные внутривенные введения 0,25 % раствора препарата (0,2 мкг/кг)), которые в течение двух суток вводили перед моделированием острого панкреатита.
В контрольные сроки исследования (1-е и 3-и сутки) животным производили релапаротомию, оценивали состояние поджелудочной железы, определяли характер ее повреждений, а также производили биопсию ее тканей, забор венозной крови.
Опыты проводились под внутривенным наркозом с использованием тиопентал-натрия из расчета 0,04 мг/кг массы тела животного. После проведения исследований животных выводили из эксперимента введением летальной дозы тиопентал-натрия.
Исследования выполнены в соответствии с нравственными требованиями к работе с экспериментальными животными, одобрены локальным этическим комитетом.
В работе применялись следующие методы исследования.
Липиды из ткани поджелудочной железы экстрагировали хлороформметаноловой смесью (Хиггинс Дж. А., 1990). Липиды фракционировали методом тонкослойной хроматографии (Хиггинс Дж. А., 1990; Vaskovsky V.E. et al., 1975). Молекулярный анализ проводили на денситометре Model GS-670 (BIO-RAD, США) с соответствующим программным обеспечением (Phosphor Analyst/PS Sowtware).
Показатели интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ): диеновые конъюгаты (ДК) определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 232-233 нм (Ганстон Ф.Д., 1986); уровень малонового диальдегида (МДА) - спектрофотометрическим методом в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Sigma), активность супероксиддисмутазы (СОД) - в реакции с нитросиним тетразолием (Гуревич В.С. и др., 1990). Активность фосфолипазы А2 исследовали в среде, содержащей 10 ммоль трис-HCL-буфер (рH 8,0), 150 ммоль тритон Х-100, 10 ммоль CaCl2 и 1,2 ммоль субстрата, в качестве которого использовали фосфатидилхолины яичного желтка (Трофимов В.А., 1999).
Измерение содержания пировиноградной кислоты (ПВК) производили при проведении реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (Кушманова О. Д., Ивченко Г. М., 1983). Содержание молочной кислоты (МК) определяли по реакции с параоксидифенилом (Меньшиков В. В., 1987).
Статистическую обработку полученных данных производили общепринятыми методами статистики с определением достоверности различий между данными в опытной и контрольной группах на основе расчета критерия Стьюдента. Выявленные закономерности и связи изучаемых параметров между группами и признаками были значимыми при вероятности безошибочного прогноза р=95 % и более.
Результаты исследования и их обсуждение
В работе при проведении экспериментального исследования показано, что выбранная модель панкреатита оказалась вполне адекватной для решения цели и задач исследования. Во всех случаях у животных возникал острый панкреатит деструктивной формы, что подтверждалось макро- и микроскопически.
Результаты, полученные в контрольной группе опытных животных, свидетельствуют о том, что при остром билиарном панкреатите наблюдается формирование нарушений липидного метаболизма, проявляющееся увеличением в тканях поджелудочной железы уровня ДК и ТБК-активных продуктов, а также фосфолипазной активности. При этом антиоксидантный потенциал исследуемых тканей значительно снижался, что выражалось падением активности СОД по сравнению с исходом на 44,4-63,8% (p<0,05) в 1-е - 3-и сутки исследования.
Состав липидов в качественном и количественном отношении в тканях поджелудочной железы характеризовался снижением уровня суммарных фосфолипидов, холестерола при увеличении количества моноацилглицеролов (МАГ), диацилглицеролов (ДАГ) и свободных жирных кислот (СЖК). Содержание триацилглицеролов изменялось неодинаково: в первые сутки имел место рост показателя, к третьим суткам - достоверное его снижение. Динамика количества эфиров холестерола была противоположной (таблица 1).
При анализе состава фосфолипидов в контрольной группе животных отмечены более высокие показатели лизофосфолипидов (ЛФЛ), сфингомиелина (СМ), фосфатидилхолина и меньшие значения фосфатидилсерина, фосфатидилинозита и фосфатидилэтаноламина (ФЭА) в сравнении с нормой (таблица 2).
Изменения липидного состава тканей поджелудочной железы при остром панкреатите сочетались с развитием гипоксических явлений в них, что проявлялось ростом уровня МК, ПВК и коэффициента гипоксии в контрольной группе животных.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при остром билиарном панкреатите происходит существенная модификация липидного метаболизма в тканевых структурах поджелудочной железы и формируется гипоксия органа, свидетельствующие о развитии мембранодеструктивных явлений в нем.
Учитывая, что в патогенезе острого панкреатита важнейшая роль принадлежит нарушениям липидного обмена, целесообразным представляется исследование фармакологических эффектов препаратов метаболического типа действия, особенно в отношении предупреждения формирования липидных дестабилизаций, что, вероятно, возможно при их превентивном применении. В качестве сравниваемых по эффективности препаратов нами выбраны эмоксипин - препарат антиоксидантного типа действия, реамберин - антигипоксант и верапамил - ингибитор кальциевых каналов (блокатор фосфолипазной активности).
Превентивное применение исследуемых препаратов в течение 2-х дней до моделирования билиарного панкреатита приводило к существенному уменьшению явлений острого панкреатита, в частности уменьшению очагов панкреонекроза. Такого рода терапия значительно влияла на анализируемые показатели липидного метаболизма в опытных группах. Наблюдалось снижение интенсивности ПОЛ в тканевых структурах поджелудочной железы, что проявлялось уменьшением количества ДК и ТБК-активных продуктов на 10,3-45,6 % (p<0,05) и 13,1-24,6 % (p<0,05) по сравнению с контролем на 1 и 3-и сутки эксперимента. Аналогичная динамика прослеживалась и в отношении фосфолипазной активности. На фоне превентивного применения препаратов в ткани воспаленной поджелудочной железы отмечено увеличение активности СОД на 21,9-121,7 % (p<0,05) по отношению к контролю на 1-3-и сутки эксперимента.
При сравнительном анализе этих опытных групп оказалось, что наибольшим влиянием при превентивном применении на интенсивность ПОЛ обладает эмоксипин.
Предварительное применение изучаемых препаратов позволило существенно влиять на состав липидов в ткани поджелудочной железы, что проявлялось достоверным повышением уровня суммарных фосфолипидов, холестерола при снижении содержания МАГ, ДАГ и СЖК. Динамика остальных показателей была менее значимой (табл. 1).
Таблица 1
Влияние некоторых препаратов на состав липидов (% от общего содержания липидов) при их превентивном применении в ткани поджелудочной железы при панкреатите (M±m, n=8 в каждой группе)
|
Показатель |
Норма |
Группа |
Этапы наблюдения |
|
|
1-е сутки |
3-и сутки |
|||
|
Суммарные фосфолипиды
|
28,88+1,01 |
I |
16,71+0,53* |
18,87+0,49* |
|
II |
23,29+0,87* P1<0,05 P2<0,05 |
27,95+0,77 P1<0,05 P2<0,05 |
||
|
III |
19,69+0,43* P3>0,05 |
24,09+0,60* P3>0,05 |
||
|
IV |
20,34+0,53* |
25,11+0,61* |
||
|
Моноацилглицеролы |
2,05+0,07 |
I |
4,02+0,14* |
5,92+0,26* |
|
II |
3,04+0,15* P1>0,05 P2<0,05 |
3,86+0,19* P1>0,05 P2>0,05 |
||
|
III |
3,42+0,15* P3>0,05 |
4,47+0,29* P3>0,05 |
||
|
IV |
3,82+0,22* |
4,15+0,10* |
||
|
Холестерол
|
28,41+1,09 |
I |
27,16+0,77 |
13,29*+0,43* |
|
II |
27,46+0,77 P1>0,05 P2>0,05 |
16,69+0,90* P1>0,05 P2>0,05 |
||
|
III |
27,10+0,70 P3>0,05 |
16,29+0,56* P3>0,05 |
||
|
IV |
27,62+0,69 |
15,34+0,62* |
||
|
Диацилглицеролы |
1,53+0,08 |
I |
2,99+0,12* |
16,05+0,33* |
|
II |
1,89+0,06* P1<0,05 P2>0,05 |
10,43+0,51* P1>0,05 P2<0,05 |
||
|
III |
2,37+0,13* P3<0,05 |
14,12+0,60* P3<0,05 |
||
|
IV |
2,02+0,05* |
11,93+0,35* |
||
|
Свободные жирные кислоты
|
5,97+0,44 |
I |
14,27+0,45* |
16,38+0,54* |
|
II |
10,67+0,60* P1<0,05 P2>0,05 |
11,77+0,53* P1<0,05 P2>0,05 |
||
|
III |
12,79+0,32* P3>0,05 |
13,35+0,63* P3>0,05 |
||
|
IV |
12,01+0,38* |
12,94+0,41* |
||
|
Триацилглицеролы
|
18,34+0,78 |
I |
28,06+0,76* |
10,07+0,47* |
|
II |
21,93+0,81* P1<0,05 P2<0,05 |
15,98+0,46* P1<0,05 P2<0,05 |
||
|
III |
24,72+0,47* P3>0,05 |
12,19+0,71* P3>0,05 |
||
|
IV |
23,10+0,45* |
15,32+0,35* |
||
|
Эфиры холестерола |
14,31+0,89 |
I |
7,43+0,38* |
18,91+0,41* |
|
II |
11,75+0,35* P1<0,05 P2>0,05 |
14,94+0,62 P1>0,05 P2<0,05 |
||
|
III |
9,05+0,37* P3<0,05 |
15,84+0,36 P3<0,05 |
||
|
IV |
10,67+0,28* |
15,14+0,58 |
||
Примечание: Здесь и далее: I - контрольная, II - опытная группа с эмоксипином, III - опытная группа с верапамилом; IV - опытная группа с реамберином; * - достоверность изменений показателей по отношению к норме при p<0,05; жирный шрифт - достоверность разницы между данными контрольной и опытной группы при p<0,05; p1<0,05 - достоверность разницы между данными II и III группы; p2<0,05 - достоверность разницы между данными II и IV группы; p3<0,05 - достоверность разницы между данными III и IV группы.
Превентивное использование препаратов позволило воздействовать на состав фосфолипидов в тканевых структурах органа. При этом наблюдалось достоверное снижение уровня ЛФЛ, СМ при увеличении показателя ФЭА на всех этапах эксперимента (табл. 2).
Таблица 2
Влияние некоторых препаратов на состав фосфолипидов (% от общего содержания липидов) при их превентивном применении в ткани поджелудочной железы при билиарном панкреатите (M±m, n=8 в каждой группе)
|
Показатель |
Норма |
Группа |
Этапы наблюдения |
|
|
1-е сутки |
3-и сутки |
|||
|
Лизофосфолипиды |
1,55±0,04 |
I |
7,65±0,32* |
14,67±0,46* |
|
II |
3,44+0,10* P1<0,05 P2<0,05 |
10,14+0,41* P1<0,05 P2<0,05 |
||
|
III |
4,21+0,11* P3>0,05 |
11,46+0,38* P3>0,05 |
||
|
IV |
4,85+0,39* |
12,04+0,41* |
||
|
Сфингомиелин
|
4,84±0,17
|
I |
8,51±0,18* |
7,46±0,08* |
|
II |
5,62+0,24* P1>0,05 P2<0,05 |
5,24+0,15 P1<0,05 P2<0,05 |
||
|
III |
6,15+0,16* P3<0,05 |
5,94+0,25* P3>0,05 |
||
|
IV |
6,95+0,11* |
6,17+0,16* |
||
|
Фосфатидилхолин
|
17,19±0,44
|
I |
18,38±0,59 |
21,80±0,37* |
|
II |
17,28+0,55 P1>0,05 P2>0,05 |
17,53+0,42 P1>0,05 P2<0,05 |
||
|
III |
17,75+0,29 P3>0,05 |
17,93+0,21 P3<0,05 |
||
|
IV |
18,08+0,23 |
18,89+0,20* |
||
|
Фосфатидилсерин
|
16,76±0,67
|
I |
17,16±0,61 |
8,35±0,24* |
|
II |
16,35+0,36 P1>0,05 P2>0,05 |
12,15+0,55* P1>0,05 P2<0,05 |
||
|
III |
16,85+0,38 P3>0,05 |
11,34+0,37* P3>0,05 |
||
|
IV |
17,04+0,13 |
10,65+0,27* |
||
|
Фосфатидилинозит
|
19,06±0,52
|
I |
16,55±0,30* |
18,06±0,52 |
|
II |
18,45+0,45 P1>0,05 P2>0,05 |
19,06+0,29 P1>0,05 P2>0,05 |
||
|
III |
18,28+0,31 P3>0,05 |
18,89+0,20 P3>0,05 |
||
|
IV |
18,08+0,23 |
19,03+0,33 |
||
|
Фосфатидилэтаноламин |
41,73±1,03
|
I |
33,88±0,78* |
29,12±1,08* |
|
II |
38,16+0,80* P1>0,05 P2>0,05 |
37,24+0,80* P1<0,05 P2<0,05 |
||
|
III |
37,77+0,34* P3>0,05 |
33,85+0,49* P3>0,05 |
||
|
IV |
36,82+0,76* |
33,64+0,81* |
||
При проведении сравнительного анализа влияния изучаемых препаратов на патологическую трансформацию состава липидов и фосфолипидов ткани поджелудочной железы оказалось, что наибольшее стабилизующее воздействие на этот патологический процесс наблюдалось при превентивном применении эмоксипина и верапамила, наименьшее - реамберина.
Предварительное введение изучаемых препаратов до моделирования патологического процесса в поджелудочной железе позволило уменьшить выраженность гипоксических процессов, что характеризовалось снижением по сравнению с данными контрольной группы показателей МК на 13,3-53,2 % (p<0,05), ПВК - на 9,9-41,4 % (p<0,05) и коэффициента гипоксии - на 9,3-20,1% (p<0,05). При сравнительном сопоставлении терапевтической эффективности изучаемых препаратов на гипоксические процессы в ткани воспаленной поджелудочной железы выяснилось, что наибольшим воздействием обладали реамберин и эмоксипин, наименьшим - верапамил.
Заключение. Проведенные экспериментальные исследования показали, что превентивное использование антиоксиданта эмоксипина, антигипоксанта реамберина, ингибитора кальциевых каналов верапамила позволяет уменьшить выраженность воспалительного процесса в ткани поджелудочной железы при моделировании острого панкреатита. Это обусловлено предупреждением резкого нарастания свободно-радикальных процессов липопереокисления, увеличения фосфолипазной активности, нарастания гипоксических процессов, что приводило к меньшей дестабилизации липидного состава биомембран панкреатоцитов. Установлено, что исследованные препараты при предварительном их применении существенным образом уменьшают выраженность мембранодеструктивных процессов в клетках поджелудочной железы при моделированном остром панкреатите, подтверждением чего явилось не только уменьшение очагов панкреонекроза, но и меньшая патологическая трансформация фосфолипидного состава биомембран клеток органа.
Работа опубликована при финансовой поддержке министерства Образования и науки РФ в рамках МК-3106.2014.7.
Рецензенты:
Смолькина А.В., д.м.н., профессор кафедры госпитальной хирургии медицинского факультета им. Т.З. Биктимирова ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск.
Бякин С.П., д.м.н., профессор кафедры госпитальной хирургии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва», г. Саранск.