Поиск и экспериментальное обоснование применения эндогенных регуляторов гомеостаза является актуальной проблемой современной медицинской науки. Ранее нами успешно продемонстрированы регуляторные свойства реактантов острой фазы альфа-1-кислого гликопротеина и церулоплазмина при экспериментальной патологии различного генеза [3]. Плейотропные эффекты эритропоэтина (ЭПО) в последнее десятилетие являются объектом внимания многих научных групп: обнаружены рецепторы ЭПО на многих клетках организма, успешно продемонстрированы эффекты ЭПО в экспериментальных и клинических условиях при патологии нервной системы, органа зрения, хронической почечной недостаточности (ХПН), кардиоваскулярной патологии и др. [2, 4-8]. Идентификация рецепторов для ЭПО на лимфоцитах и других иммунокомпетентных клетках позволяет предположить иммунотропные эффекты этого гликопротеина [9]. Результаты исследований за последние 20 лет позволили рассматривать систему эритропоэтин-рецептор эритропоэтина на ауто- и паракринном уровне как звено неспецифической защиты при повреждении, а рецепторы эритропоэтина на неэритроидных клетках обозначаются как защищающие ткань рецепторы. ХПН является удобной моделью для исследования плейотропных эффектов ЭПО, принимая во внимание факт критического снижения эндогенной продукции ЭПО пери- и тубулярными клетками почек. Цель работы - исследовать влияние ЭПО на показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной ХПН.
Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 115 белых нелинейных крысах массой 180-220 г., находящихся в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г. Все манипуляции с животными выполнялись в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.) и положениями Хельсинской Декларации ВОЗ (1997). Группа I - контрольная, ложнооперированные животные; группа II - животные с ХПН; группа III - животные, которым на фоне ХПН вводили ЭПО. Модель ХПН у крыс создавали путем двухэтапной оперативной резекции 5/6 почечной ткани [10]. Терминальная стадия ХПН развивалась через 21 сутки, критериями служили повышение в сыворотке концентрации креатинина (> 60 мкмоль/л), мочевины (> 5 ммоль/л). Животным III группы, начиная с 21 суток эксперимента, внутрибрюшинно, ежедневно вводили рекомбинантный человеческий ЭПО в составе препарата «Эпокрин» (эпоэтин альфа, ГНИИ Особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург) применяли в дозе 100 МЕ/кг массы тела в течение 9 дней. Животным I и II группы вводили эквиобъемное количество стерильного физиологического раствора. Исследования проводили на 30 сутки. Количество лейкоцитов в периферической крови и лейкоцитарную формулу определяли общепринятыми методами. Исследование поглотительной способности лейкоцитов периферической крови проводили c использованием частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистерольного латекса, учитывали активность фагоцитоза (ФА) - % клеток, захвативших хотя бы одну частицу латекса, интенсивность фагоцитоза (ФИ) - число поглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных клетках и фагоцитарное число (ФЧ) - число поглощенных микросфер латекса на один фагоцит. Исследование кислород-зависимого метаболизма фагоцитов периферической крови проводили, учитывая интенсивность восстановления нитросинеготетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму - диформазан, по методу А.Н. Маянского. Проводили спонтанный и индуцированный НСТ-тест с учетом активности (% клеток) и интенсивности (у.е.). Т-хелпер-2 (Th-2) - зависимый иммунный ответ оценивали по количеству антителообразующих клеток в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, по методу A. J. Cunningham[1]. Тh1-зависимый иммунный ответ исследовали по реакции гиперчувствительности замедленного типа у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, интенсивность реакции оценивали по выраженности воспалительного отека стопы, в которую вводили аллогенные эритроциты, использовавшиеся для предварительной иммунизации. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ StatisticaforWindowsv.10.0. Проверку статистических гипотез проводили с использованием критериев Краскела - Уоллиса, Манна - Уитни, Вальда - Вольфовитца.
Результаты исследования и их обсуждение. Особенностями исследования иммунного статуса при экспериментальной ХПН при сравнении с клинической группой больных ХПН является типовое у всех животных развитие синдрома ХПН после резекции 5/6 почечной ткани, независимое от первичного заболевания (артериальная гипертензия, сахарный диабет, гломерулопатии и др.), отсутствие влияния сопутствующей патологии, системного эффекта гемодиализной процедуры, антикоагулянтов и других групп лекарственных препаратов. Это позволяет оценить иммунный статус в условиях терминальной стадии ХПН с исключением влияния сторонних факторов, способных модифицировать иммунный ответ за счет изменения количественного состава и функциональной активности иммунокомпетентных клеток.
При экспериментальной ХПН в периферической крови изменяется относительное количество популяций лейкоцитов: повышается количество нейтрофилов за счет сегментоядерных форм и снижается количество лимфоцитов без выхода за границы референсных значений. Пересчет показателей в абсолютные величины показал статистически значимое увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов (в среднем на 62,1 % по сравнению с группой контроля), моноцитов (в среднем на 29,0 % по сравнению с группой контроля) и снижение количества лимфоцитов (в среднем на 38,2 % по сравнению с группой контроля). Общее количество лейкоцитов в крови достоверно не изменялось за счет того, что количество одних клеток увеличивалось, а других - уменьшалось (табл. 1). При исследовании врожденного иммунитета зафиксировано увеличение активности, интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа (табл. 2). Повышение активности фагоцитоза может быть связано с увеличением в периферической крови количества фагоцитирующих клеток - сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов. Отмечено повышение активности и индекса спонтанного НСТ-теста без изменения показателей индуцированного НСТ-теста. Оценка адаптивного иммунитета установила снижение интенсивности реакции ГЗТ, косвенно свидетельствующая об угнетении Th1-зависимого иммунного ответа, и уменьшение количества АОК в селезенке, демонстрирующее подавление Th2-зависимого иммунного ответа (табл. 3).
Полагают, что одним из механизмов лимфоцитопении при ХПН выступает повышение концентрации в плазме крови индоламина-2,3-диоксигеназы и аргиназы I типа, участвующих в катаболизме соответственно триптофана и аргинина. Установлены проапоптотическое и антипролиферативное действие индоламина-2,3-диоксигеназы и аргиназы I типа на Т-клетки, их концентрация в крови обратно пропорциональна абсолютному количеству лимфоцитов. Патогенез активации функциональной активности фагоцитов при ХПН является многофакторным: имеют значение азотемия, нарушение обмена витамина D, гиперпаратиреоз и сопутствующее нарушение фосфорно-кальциевого обмена, нарушение обмена железа, анемия, активация РААС, гемодиализная процедура и др. факторы.
Применение ЭПО при экспериментальной ХПН приводит к уменьшению количества нейтрофилов в периферической крови за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм (табл. 1). Количество лимфоцитов в крови повышалось на правах тенденции относительной группы животных с ХПН и достоверно не отличалось от группы ложнооперированных животных. При исследовании функциональной активности фагоцитирующих клеток установлено снижение интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа, однако показатели поглотительной способности фагоцитов не достигали значений в группе ложнооперированных животных. В условиях применения ЭПО снижалась активность и интенсивность спонтанного НСТ-теста, показатели не отличались от значений в группе ложнооперированных животных. ЭПО нормализует показатели адаптивного иммунитета при ХПН: интенсивность реакции ГЗТ и количество АОК в селезенке повышались и достигали значений в группе ложнооперированных животных. Таким образом, ЭПО при экспериментальной ХПН выступает в роли регулятора количественного состава лейкоцитов в крови, функциональной активности фагоцитов и показателей клеточного и гуморального звеньев адаптивного иммунитета.
Механизм иммунотропных эффектов ЭПО может быть связан с его дезинтоксикационным и антиоксидантным действием, ранее нами продемонстрировано, что применение ЭПО при экспериментальной ХПН приводит к снижению концентрации креатинина и продуктов процессов перекисного окисления липидов в сыворотке [6]. Кроме того, ЭПО как антиапоптогенный фактор может ограничивать гибель лимфоцитов в кровотоке.
Таблица 1
Влияние ЭПО на количество лейкоцитов в крови при ХПН (M±m)
|
Показатели |
Группа 1 Л/оперирир. (n=22) |
Группа 2 ХПН (n=24) |
Группа 3 ХПН +ЭПО(n=29) |
|
Лейкоциты, • 109/л |
8,59±0,78 |
9,13±0,74 |
8,46±0,45 |
|
Эозинофилы, • 109/л |
0,21±0,04 |
0,19±0,03 |
0,28±0,05 |
|
Нейтрофилып/ядерные, • 109/л |
0,29±0,06 |
0,34±0,05 |
0,19±0,03* ** |
|
Нейтрофилы с/ядерные, • 109/л |
3,19±0,35 |
5,17±0,46* |
3,82±0,28** |
|
Нейтрофилы всего, • 109/л |
3,49±0,39 |
5,51±0,49* |
4,00±0,30** |
|
Лимфоциты, • 109/л |
4,27±041 |
2,64±0,20* |
3,27±0,21 |
|
Моноциты, • 109/л |
0,62±0,12 |
0,80±0,13 |
0,89±0,09* |
Примечание. Здесь и далее * - статистически значимые (р<0,05) различия с группой 1, ** - с группой 2.
Таблица 2
Влияние ЭПО на показатели врожденного иммунитета при ХПН (M±m)
|
Показатели |
Группа 1 Л/оперирир. (n=19) |
Группа 2 ХПН (n=15) |
Группа 3 ХПН +ЭПО (n=29) |
|
Активность фагоцитоза, % |
32,37±2,01 |
45,20±3,05* |
41,21±2,16* |
|
Интенсивность фагоцитоза, у.е. |
0,65±0,05 |
1,25±0,20* |
0,93±0,09* ** |
|
Фагоцитарное число, у.е. |
2,21±0,09 |
3,60±0,29* |
2,34±0,17* ** |
|
НСТ-тест спонт., активность, % |
8,67±1,69 |
18,00±2,29* |
12,10±1,47** |
|
НСТ-тест спонт., индекс, у.е. |
0,14±0,03 |
0,29±0,05* |
0,16±0,03** |
|
НСТ-тест инд., активность, % |
15,05±2,79 |
20,36±1,83 |
15,26±1,08 |
|
НСТ-тест инд., индекс, у.е. |
0,19±0,04 |
0,28±0,03* |
0,18±0,02 |
Таблица 3
Влияние ЭПО на показатели адаптивного иммунитета при ХПН (M±m)
|
Показатели |
Группа 1 Л/оперирир. (n=15) |
Группа 2 ХПН (n=11) |
Группа 3 ХПН +ЭПО(n=14) |
|
ГЗТ, мл |
0,48±0,07 |
0,26±0,04* |
0,40±0,04** |
|
АОК, 104 |
597,06±140,28 |
257,17±59,54* |
955,76±167,67** |
|
АОК, ед. / 106 ЯСК |
536,07±177,32 |
154,16±65,65* |
967,97±317,80** |
Выводы
- При экспериментальной ХПН в периферической крови увеличивается абсолютное количество фагоцитирующих клеток (сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов), снижается количество лимфоцитов.
- Активация врожденного иммунитета при экспериментальной ХПН проявляется увеличением поглотительной способности и кислород-зависимого метаболизма фагоцитирующих клеток. При оценке адаптивного иммунитета зафиксировано угнетение клеточного (T-хелпер-1-зависимого) и гуморального (T-хелпер-2-зависимого) иммунного ответа.
- Применение ЭПО в суммарной дозе 900 МЕ/кг при экспериментальной ХПН приводит к восстановлению количественного состава лейкоцитов в периферической крови, поглотительной активности и кислород-зависимого метаболизма фагоцитов в крови, показателей Т-хелпер-1 и Т-хелпер-2- зависимого иммунного ответа.
Рецензенты:
Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Челябинск.
Абрамовских О.С., д.м.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Челябинск.