Введение
Лактулоза – углевод, признанный бифидус-фактор, широко изучаемый как профилактическое и терапевтическое средство при ряде заболеваний, особенно в случае формирования дисбиотических явлений. В научной школе СКФУ «Живые системы» активно ведется разработка технологий получения лактулозы и продуктов лечебного и функционального назначения, содержащих лактулозу [6]. Основной механизм действия лактулозы связывают с вовлечением в её метаболизм бактерий, которые могут обуславливать косвенный антиоксидантный эффект в организме млекопитающих [9]. Данный эффект лактулозы слабо исследован, а в условиях роста загрязнения окружающей среды [2] может быть одним из подходов создания функциональных продуктов для загрязненных территорий. Кадмий известен как металл, инициирующий развитие оксидативных процессов в целом организме [5] и влияющий на уровень гормонов [1].
Учитывая возможность прямого доступа молекул лактулозы в кровь [10], ранее были проведены исследования на эритроцитах in vitro. Выявлена различная протективная функция лактулозы при действии хлорида кадмия в зависимости от технологии производства. Наибольшую биологическую активность показал образец сиропа лактулозы, полученного путем изомеризации лактозы в лактулозу по ТУ BY 100377914.512-2008 (Беларусь) [3]. Это послужило основой для проведения модельных экспериментов по проверке антиоксидантной активности (АОА) различных образцов лактулозы при моделировании окислительных процессов с использованием хлорида кадмия.
Материалы и методы
Исследования проведены на 3-х образцах: препарат фирмы Иналко (Италия) с содержанием лактулозы – 98 % (Л1), сироп «Лазет» (ООО «Шехонь-Лактулоза», Россия) с содержанием лактулозы – 41 % (Л2), концентрат пищевой лактулозы, подготовленный по ТУ BY 100377914.512-2008 (Беларусь) с содержанием лактулозы – 34 % (Л3). Проводили сравнение АОА данных образцов лактулозы методом FRAP (ferris reducing/antioxidant pover). В ходе этого анализа под действием антиоксидантов (восстановителей) образуются комплексы железа (II) с фотометрическим реагентом. Для оценки их количества измеряли оптическую плотность при λ = 490 нм с помощью спектрофотометра СФ-46. Рассчитывали величину антиоксидантной активности по градуировочному графику [7]. В модели с суспензией липопротеидов желтка куриных яиц АОА оценивали в относительных единицах (%) в соответствии с ранее описанной моделью [4]. В экспериментальных моделях изучали АОА с добавлением сырого молока. Внесение лактулозы производилось из расчета 5 мг/мл в модельной системе. Поскольку моделировали загрязнение кадмием молока, исходили из норм, определяемых Федеральным Законом от 12.06.2008 № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию»: допустимый уровень содержания в сыром молоке кадмия 0,03 мг/л, что соответствует ПДК (предельно допустимая концентрация). В модельной смеси (молоко) концентрация кадмия соответствовала значениям ПДК. Все эксперименты проведены в 3-х кратной повторности.
Изучение перекисных процессов проводили на самцах крыс линии Вистар. Оксидативный стресс моделировали ежедневным добавлением в питьевую воду раствора хлорида кадмия. Сравнивали антиоксидантный эффект растворов лактулозы. Для проведения исследования сформировано четыре группы животных: 1-я (контрольная) группа – крысы, получавшие питьевую воду; 2-я группа – животные, получавшие 1 месяц питьевую воду с хлоридом кадмия в дозе 50 ppm; 3-я и 4-я группа – животные, получавшие 1 месяц питьевую воду с хлоридом кадмия в дозе 50 ppm и сироп лактулозы 5 мг/мл (0,5 %) различных производителей: 3гр – препарат фирмы Иналко (Италия) (образец Л1), 4гр – концентрат пищевой лактулозы ТУ BY 100377914.512-2008 (Беларусь) (образец Л3). Питьевая вода с данными растворами давалась животными ad libitum. Кровь забиралась из хвостовой вены через месяц после начала эксперимента под эфирным наркозом. Содержание продуктов перекисного окисления липидов определяли в соответствии с инструкцией набора реактивов «ТБК-Агат».
Результаты исследования и их обсуждение
Для сравнительной оценки уровня АОА различных образцов лактулозы в модельном эксперименте подобраны адекватные и наиболее часто используемые методы для оценки пищевых компонентов. Выявлена схожая динамика изменения АОА в использованных методиках. Образец Л1 проявил наименьшую АОА, а наибольшую активность проявил образец Л3. В дальнейшем при эксперименте с кадмием использовали образец лактулозы с наибольшей АОА (рисунок 1).
Для сравнения степени АОА образца Л3 исследовали её зависимость от роста концентрации кадмия. Добавление Л3 в модельную систему с сырым молоком увеличило АОА на 20 %. Рост ПДК кадмия в молоке значительно не менял АОА, что может быть обусловлено активацией АОА молока [8]. Добавление Л3 к образцам, загрязненным кадмием, увеличивало АОА на 16–19 % в сравнении с пробами без лактулозы. Следовательно, использование образца Л3 увеличивало антиоксидантную активность и способствовало понижению уровня образования продуктов перекисного окисления в условиях действия тяжелых металлов в сыром молоке-сырье (таблица 1).
Образец сиропа лактулозы Л3 в соответствии с ТУ ВY 100377914.512 – 2008 и физико-химическим характеристикам (таблица 2) в своем составе может содержать побочные продукты изомеризации лактозы в лактулозу, проявляющих антиоксидантную активность. Учитывая, что химически чистая лактулоза не проявляет антиоксидантную активность и ее молекулярная масса составляет 342,3 г/моль, проведено выделение активных компонентов сиропа.
Рисунок 1. Оценка АОА различных образцов сиропов лактулозы в модели с липопротеидами желтка куриных яиц (%, сплошная линия) и методом FRAP (по аскорбиновой кислоте – мкг/мл, пунктирная линия)
Таблица 1. Уровень АОА в зависимости от концентрации кадмия в модельной системе
|
Концентрация тяжелых металлов |
ТМ+молоко |
ТМ+молоко +лактулоза (Л3) |
|
Контроль |
75,8% |
96,5% |
|
(1ПДК) Cd 0,03мг/кг |
77,1% |
96,1% |
|
(2ПДК) Cd0,06мг/кг |
78,0% |
95,5% |
|
(10ПДК) Cd0,3мг/кг |
77,6% |
94,4% |
Таблица 2. Физико-химические показатели сиропа лактулозы (Л3)
|
Наименование показателя |
Норма для продукта |
|
Массовая доля сухих веществ, %, не менее |
60,0 |
|
Массовая доля лактулозы, %, не менее |
45,0 |
|
Массовая доля лактозы, %, не более |
10,0 |
|
Массовая доля золы, %, не более |
1,0 |
|
Натрий – карбоксиметилцеллюлозы %, не более |
0,3 |
|
Плотность, кг/м3, не менее |
1280 |
Для выявления молекулярной массы компонентов сиропа, проявляющих наибольшую АОА, проводили его диализ и проверку АОА компонентов с различной молекулярной массой. Использованы диализные мешки с размером пор 12–14 кДа, 6–8 кДа, 3,5 кДа (CelluSep, производитель MFPI). Диализ проводили против дистиллированной воды 48 часов. Оценка выявила рост АОА концентрата в диализном мешке с уменьшением размеров молекул. Выявлено, что АОА меняется с молекулярной массой компонентов сиропа. Наибольшую АОА (72 %) проявил раствор с размером молекул более 3,5 кДа, но менее 6–8 кДа (рисунок 2), что указывает на АОА не лактулозы, а сиропа в целом.
Рисунок 2. Уровень АОА компонентов сиропа с различной молекулярной массой лактулозы после диализа
В исследованиях на крысах показано, что употребление животными в течение месяца воды, загрязненной хлоридом кадмия, привело к росту количества перекисей в плазме крови в сравнении с контролем. Совместное употребление исследуемых образцов лактулозы с хлоридом кадмия снижает уровень ТБК-активных продуктов в плазме крови крыс, что указывает на антиоксидантный эффект сиропов лактулозы. Использование образцов Л1 и Л3 выявило различие их АОА. Образец Л3 вызвал достоверное снижение ТБК-активных продуктов в плазме крови животных в сравнении с лактулозой (Л1). Выявленные изменения АОА могут указывать на синергетический эффект лактулозы и компонентов сиропа с молекулярной массой более 3 кДа, проявляющих наибольшую антиоксидантную активность (рисунок 3). Возможно, что уже известные свойства лактулозы позволяют активировать резервы организма и снизить уровень окисленных продуктов [1, 9].
Рисунок 3. Уровень ТБК-активных продукты (в ед. опт. плотности) в плазме крови крыс, потреблявших различные образцы сиропа лактулозы, при действии хлорида кадмия
Заключение
Таким образом, изучение трех образцов лактулозы при моделировании окислительных процессов с использованием хлорида кадмия выявило наибольшую антиоксидантную активность образца Л3 (ТУ BY 100377914.512-2008). Использование образца Л3 увеличивало АОА и способствовало понижению уровеня образования продуктов перекисного окисления в условиях действия тяжелых металлов в сыром молоке-сырье. В моделях наибольшую АОА проявил раствор с размером молекул более 3,5 кДа, но менее 6–8 кДа. В исследованиях in vivo показана антиоксидантная активность лактулозы при моделировании кадмиевой интоксикации. Наибольшую активность проявил образец Л3, что может быть обусловлено синергетическим эффектом антиоксидантых компонентов и метаболитов микроорганизмов [9]. Полученные данные позволяют рассматривать данный образец в применении как антиоксидант в функциональных продуктах питания.
Рецензенты:
Криворучко А.Ю., д.б.н., руководитель научно-диагностического и лечебно-ветеринарного центра, ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» Минсельхоза России, г. Ставрополь.
Бондарь Т.П., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации, ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет» Минобрнауки РФ, г. Ставрополь.