Введение
Чернушка посевная (Nigella sativa L.) – перспективный источник ценнейших биологически активных веществ (БАВ), семена которой используются с лечебной целью в таких областях, как гастроэнтерология, онкология, кардиология, аллергология, гинекология и инфектология [9]. Такой разнообразный спектр направлений использования семян чернушки обусловлен ее богатейшим компонентным составом жирного и эфирного масла [5, 9, 10]. В настоящее время из семян чернушки посевной получают жирное масло методом холодного отжима и экстракционным путем [8]. Однако используемые способы получения позволяют извлекать из растительного сырья в основном гидрофобные группы веществ (жирные кислоты и компоненты эфирного масла). Хотя, помимо липофильных соединений семян чернушки посевной, определяющих ее медицинское применение, заслуживают внимания и гидрофильные вещества как носители разных фармакологических видов активности. В этой связи присутствие гидрофильных веществ, наряду с гидрофобными, будет способствовать расширению спектра фармако-биологического действия комплексных продуктов из чернушки посевной. К одним из современных, эффективных и экологически чистых способов, позволяющих извлекать из растительного сырья различной по полярности природы БАВ, можно отнести активно внедряющую в фармацевтическую промышленность технологию сверхкритических флюидов. Фитоэкстракты, полученные данным способом, содержат в нативном виде все извлеченные БАВ, являются практически стерильными, зачастую содержат природные антиоксиданты, позволяющие сохранить продукт в процессе хранения и исключить использование синтетических консервантов [1, 7].
Согласно данным [11], в семенах чернушки содержатся в достаточно большом количестве аминокислоты. Присутствие аминокислот в разрабатываемых целевых продуктах из чернушки в сочетании с гидрофобными БАВ повысило бы их фармако-терапевтическую ценность. Аминокислоты участвуют в продукции ферментов, некоторых гормонов, в построении мышц, кожи и волос, поддерживают работу иммунной системы и общего обмена веществ. Помимо этого, некоторые аминокислоты действуют в качестве нейротрансмиттеров – передатчиков информации от одной клетки к другой.
Таким образом, исследование аминокислот в экстрактах чернушки посевной, полученных методом сверхкритической углекислотной экстракции при различных режимах СО2, и их сравнительная оценка представляет интерес для разработки продуктов с сочетанным содержанием гидрофобных и гидрофильных БАВ и потенциально обладающих полифункциональным лечебно-профилактическим действием.
Целью исследования являлось сравнительное изучение аминокислотного состава экстрактов из семян чернушки посевной, полученных методом сверхкритической углекислотной экстракции.
Материал и методы исследования
Объектом исследования служили экстракты №1, №2, №3 из семян чернушки посевной, полученные при различных режимах методом сверхкритической углекислотной экстракцией. Режимы экстракции отличались увеличивающимися значениями температуры и давления (равный прирост) в ряду: экстракт №1˃ экстракт №2 ˃ экстракт №3.
Сравнительное исследование аминокислотного состава экстрактов из семян чернушки осуществляли методом капиллярного электрофореза на приборе «Капель-103Р» (ОАО «НПФ Люмэкс», Россия) с кварцевым капилляром Lэфф/Lобщ=50/60 см, ID=75 мкм. Данный метод основан на разделении анионных форм N-фенилтиокарбамил-производных аминокислот под действием электрического поля вследствие их различной электрофоретической подвижности. Пробоподготовку проводили путем СВЧ-экстракции сверхкритических углекислотных экстрактов из семян чернушки посевной 10% спиртом этиловым на СВЧ-минерализаторе «Минотавр-1». Точную навеску экстракта в количестве 1,0 г помещали во фторопластовый контейнер СВЧ-минерализатора, добавляли 25 мл 10% спирта этилового, устанавливали контейнер в магнетрон минерализатора. Минерализацию проводили, используя режим «разложение без давления», в течение 10 мин. По истечении указанного времени контейнер извлекали из СВЧ-минерализатора, охлаждали в естественных условиях в течение 3-5 мин. Полученное извлечение количественно переносили в мерную колбу объемом 25 мл [2, 3].
К полученному извлечению добавляли 10% водный раствор карбоната натрия и раствор фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте. Реакционную смесь перемешивали, выдерживали в течение 35 минут при комнатной температуре для прохождения реакции между фенилизотиоцианатом и аминокислотами, содержащимися в экстрактах из семян чернушки посевной, после чего высушивали в потоке теплого воздуха. К сухому остатку прибавляли воду очищенную, тщательно перемешивали и центрифугировали при 6000 об-1 в течение 5 минут, полученную пробу (фугат) переносили в систему капиллярного электрофореза и пневматическим методом под давлением 30 миллибар в течение 5 секунд дозировали пробу в капилляр. Капилляр перед измерением подготавливали к работе, промывая его последовательно 3,5% раствором соляной кислоты, водой очищенной, 4% раствором гидроксида натрия и рабочим буферным раствором. Электрофорез проводили под напряжением в 10 кВольт. Анализируемую пробу дозировали в прибор не менее двух раз. Градуировку прибора осуществляли при помощи калибровочных растворов стандартных образцов аминокислот. Градуировочную смесь готовили путем смешения исходных растворов аминокислот, 10% водного раствора карбоната натрия и раствора фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте. Для идентификации и количественного определения анализируемых компонентов регистрировали ультрафиолетовое поглощение при длине волны 254 нм. По электрофореграмме определяли качественную характеристику вещества – время миграции и количественную (после построения градуировочной зависимости) – высоту или площадь пика, пропорциональную концентрации вещества [4, 6]. Массовую концентрацию аминокислот в исследуемой пробе (Х) вычисляли по формуле:
где
К – коэффициент разбавления пробы;
С – концентрация аминокислоты, найденная по градуировочному графику, мг/кг.
Результаты исследования и их обсуждение
Обобщенные результаты качественного и количественного аминокислотного состава сверхкритических углекислотных экстрактов из семян чернушки посевной, полученные с помощью метода капиллярного электрофореза, представлены в таблице.
Таблица
Качественный и количественный состав аминокислот сверхкритических углекислотных экстрактов из семян чернушки посевной
|
Качественный состав аминокислот |
Количественный состав аминокислот, мг/кг |
||
|
Экстракт №1 |
Экстракт №2 |
Экстракт №3 |
|
|
Аргинин |
30,86±0,56 |
14,25±0,42 |
34,98±1,22 |
|
Лейцин |
- |
1,32±0,04 |
19,15±0,57 |
|
Метионин |
- |
0,002±0,0004 |
7,79±0,23 |
|
Валин |
- |
0,46±0,014 |
0,06±0,002 |
|
Пролин |
16,90±0,29 |
4,65±0,12 |
25,70±0,77 |
|
Треонин |
2,81±0,23 |
0,31±0,008 |
41,45±1,16 |
|
Серин |
- |
0,61±0,02 |
12,53±0,36 |
|
α-Аланин |
- |
0,27±0,008 |
28,39±0,85 |
|
Глицин |
- |
- |
5,29±0,15 |
|
Сумма аминокислот |
50,57±1,08 |
21,87±0,63 |
175,34±5,31 |
Как видно из данных таблицы, в экстракте №1 были обнаружены аргинин, пролин и треонин, суммарное содержание которых составило 50,57±1,08 мг/кг. В составе экстракта №2 идентифицированы аргинин, лейцин, метионин, валин, пролин, треонин, серин и α-аланин, концентрация которых оказалась равной 21,87±0,63 мг/кг. Наиболее широко представлен качественный состав экстракта №3 (рис.), содержащий незаменимые (лейцин, аргинин, метионин, валин, треонин) и заменимые (пролин, серин, аланин, глицин) аминокислоты. По количественному содержанию экстракт №3 (175,34±5,31 мг/кг) также преобладает над экстрактами №1 и №2, что свидетельствует о большей степени извлекаемости аминокислот из растительного сырья с повышением температуры и давления в процессе сверхкритической углекислотной экстракции.
Рисунок. Электрофореграмма аминокислотного состава флюидного экстракта №3
Заключение
В результате проведенных исследований установлено наличие аминокислот в сверхкритических углекислотных экстрактах №1, №2 и №3 из семян чернушки посевной. Сравнительный анализ аминокислотных составов во флюидных экстрактах чернушки посевной позволили дифференцировать их по степени насыщенности гидрофильными соединениями – аминокислотами. Наиболее богатым по составу аминокислот оказался экстракт №3, при получении которого использовались высокие значения давления и температуры, в отличие от других получаемых экстрактов. Таким образом, регулируя отдельные параметры (температуру и давление) при производстве фитоэкстрактов из чернушки посевной методом сверхкритической углекислотной экстракции можно получать готовый продукт, содержащий комплекс гидрофобных (жирные кислоты и компоненты эфирного масла) и гидрофильных БАВ, в частности, аминокислот.
Рецензенты:
Дроздова И.Л., д.фарм.н., декан фармацевтического и биотехнологического факультетов, профессор кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Курск.
Коновалов Д.А., д.фарм.н., заведующий кафедрой фармакогнозии пятигорского филиала ГБОУ ВПО Волгоградского государственного медицинского университета Минздрава России, г. Пятигорск.