Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

COMPARATIVE STUDY OF AMINO ACID COMPOSITION SUPERCRITICAL CAR-BON DIOXIDE EXTRACTS RINGLETS SEEDING FROM SEED

Rud N.K. 1 Sampiev A.M. 1
1 Kuban State Medical University
The aim of the study was a comparative study of the amino acid composition of supercritical carbonic acidic The aim of the study was a comparative study of the amino acid composition of supercritical - yi lekislotnyh extracts from seeds Nigella seed. The object of the study were extracts № 1, № 2, № 3 of seeds Nigella seed obtained in dif-ferent modes by supercritical carbon dioxide extraction. Study of the amino acid composition was performed by capillary electrophoresis instrument " Capel- 103R ", based on the separation of anionic forms of N- feniltiokar-bamil - amino acid derivatives in the electric field due to their dif-ferent electrophoretic mobility . For identifica-tion and quantification of amino acids were recorded ultraviolet absorption at a wavelength of 254 nm. Number 1 in the extract were detected arginine, proline and threonine, total content was 50.57 mg / kg. In ve extract amount-ed number 2 identified arginine, leucine, methionine, valine, proline, threonine, serine, α- alanine, which was equal to the concentration of 21.87 mg / kg. The most widely represented qualitative in the extract composition number 3, containing five essential (leucine, arginine, methionine, valine, threonine ) and four replaceable ( proline, serine, alanine, glycine ) residue. Total quantitative amino acid content in the extract number 3 was 175.34 mg / kg, indi-cating a greater degree of recoverability of plant materials in the specified mode of supercritical carbon dioxide extraction.
capillary electrophoresis
amino acids
Nigella seeds

Введение

Чернушка посевная (Nigella sativa L.) – перспективный источник ценнейших биологически активных веществ (БАВ), семена которой используются с лечебной целью в таких областях, как гастроэнтерология, онкология, кардиология, аллергология, гинекология и инфектология [9]. Такой разнообразный спектр направлений использования семян чернушки обусловлен ее богатейшим компонентным составом жирного и эфирного масла [5, 9, 10]. В настоящее время из семян чернушки посевной получают жирное масло методом холодного отжима и экстракционным путем [8]. Однако используемые способы получения позволяют извлекать из растительного сырья в основном гидрофобные группы веществ (жирные кислоты и компоненты эфирного масла). Хотя, помимо липофильных соединений семян чернушки посевной, определяющих ее медицинское применение, заслуживают внимания и гидрофильные вещества как носители разных фармакологических видов активности. В этой связи присутствие гидрофильных веществ, наряду с гидрофобными, будет способствовать расширению спектра фармако-биологического действия комплексных продуктов из чернушки посевной. К одним из современных, эффективных и экологически чистых способов, позволяющих извлекать из растительного сырья различной по полярности природы БАВ, можно отнести активно внедряющую в фармацевтическую промышленность технологию сверхкритических флюидов. Фитоэкстракты, полученные данным способом, содержат в нативном виде все извлеченные БАВ, являются практически стерильными, зачастую содержат природные антиоксиданты, позволяющие сохранить продукт в процессе хранения и исключить использование синтетических консервантов [1, 7].

Согласно данным [11], в семенах чернушки содержатся в достаточно большом количестве аминокислоты. Присутствие аминокислот в разрабатываемых целевых продуктах из чернушки в сочетании с гидрофобными БАВ повысило бы их фармако-терапевтическую ценность. Аминокислоты участвуют в продукции ферментов, некоторых гормонов, в построении мышц, кожи и волос, поддерживают работу иммунной системы и общего обмена веществ. Помимо этого, некоторые аминокислоты действуют в качестве нейротрансмиттеров – передатчиков информации от одной клетки к другой.

Таким образом, исследование аминокислот в экстрактах чернушки посевной, полученных методом сверхкритической углекислотной экстракции при различных режимах СО2, и их сравнительная оценка представляет интерес для разработки продуктов с сочетанным содержанием гидрофобных и гидрофильных БАВ и потенциально обладающих полифункциональным лечебно-профилактическим действием.

Целью исследования являлось сравнительное изучение аминокислотного состава экстрактов из семян чернушки посевной, полученных методом сверхкритической углекислотной экстракции.

Материал и методы исследования

Объектом исследования служили экстракты №1, №2, №3 из семян чернушки посевной, полученные при различных режимах методом сверхкритической углекислотной экстракцией. Режимы экстракции отличались увеличивающимися значениями температуры и давления (равный прирост) в ряду: экстракт №1˃ экстракт №2 ˃ экстракт №3.

Сравнительное исследование аминокислотного состава экстрактов из семян чернушки осуществляли методом капиллярного электрофореза на приборе «Капель-103Р» (ОАО «НПФ Люмэкс», Россия) с кварцевым капилляром Lэфф/Lобщ=50/60 см, ID=75 мкм. Данный метод основан на разделении анионных форм N-фенилтиокарбамил-производных аминокислот под действием электрического поля вследствие их различной электрофоретической подвижности. Пробоподготовку проводили путем СВЧ-экстракции сверхкритических углекислотных экстрактов из семян чернушки посевной 10% спиртом этиловым на СВЧ-минерализаторе «Минотавр-1». Точную навеску экстракта в количестве 1,0 г помещали во фторопластовый контейнер СВЧ-минерализатора, добавляли 25 мл 10% спирта этилового, устанавливали контейнер в магнетрон минерализатора. Минерализацию проводили, используя режим «разложение без давления», в течение 10 мин. По истечении указанного времени контейнер извлекали из СВЧ-минерализатора, охлаждали в естественных условиях в течение 3-5 мин. Полученное извлечение количественно переносили в мерную колбу объемом 25 мл [2, 3].

К полученному извлечению добавляли 10% водный раствор карбоната натрия и раствор фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте. Реакционную смесь перемешивали, выдерживали в течение 35 минут при комнатной температуре для прохождения реакции между фенилизотиоцианатом и аминокислотами, содержащимися в экстрактах из семян чернушки посевной, после чего высушивали в потоке теплого воздуха. К сухому остатку прибавляли воду очищенную, тщательно перемешивали и центрифугировали при 6000 об-1 в течение 5 минут, полученную пробу (фугат) переносили в систему капиллярного электрофореза и пневматическим методом под давлением 30 миллибар в течение 5 секунд дозировали пробу в капилляр. Капилляр перед измерением подготавливали к работе, промывая его последовательно 3,5% раствором соляной кислоты, водой очищенной, 4% раствором гидроксида натрия и рабочим буферным раствором. Электрофорез проводили под напряжением в 10 кВольт. Анализируемую пробу дозировали в прибор не менее двух раз. Градуировку прибора осуществляли при помощи калибровочных растворов стандартных образцов аминокислот. Градуировочную смесь готовили путем смешения исходных растворов аминокислот, 10% водного раствора карбоната натрия и раствора фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте. Для идентификации и количественного определения анализируемых компонентов регистрировали ультрафиолетовое поглощение при длине волны 254 нм. По электрофореграмме определяли качественную характеристику вещества – время миграции и количественную (после построения градуировочной зависимости) – высоту или площадь пика, пропорциональную концентрации вещества [4, 6]. Массовую концентрацию аминокислот в исследуемой пробе (Х) вычисляли по формуле:

где

К – коэффициент разбавления пробы;

С – концентрация аминокислоты, найденная по градуировочному графику, мг/кг.

Результаты исследования и их обсуждение

Обобщенные результаты качественного и количественного аминокислотного состава сверхкритических углекислотных экстрактов из семян чернушки посевной, полученные с помощью метода капиллярного электрофореза, представлены в таблице.

Таблица

Качественный и количественный состав аминокислот сверхкритических углекислотных экстрактов из семян чернушки посевной

Качественный состав аминокислот

Количественный состав аминокислот, мг/кг

Экстракт №1

Экстракт №2

Экстракт №3

Аргинин

30,86±0,56

14,25±0,42

34,98±1,22

Лейцин

-

1,32±0,04

19,15±0,57

Метионин

-

0,002±0,0004

7,79±0,23

Валин

-

0,46±0,014

0,06±0,002

Пролин

16,90±0,29

4,65±0,12

25,70±0,77

Треонин

2,81±0,23

0,31±0,008

41,45±1,16

Серин

-

0,61±0,02

12,53±0,36

α-Аланин

-

0,27±0,008

28,39±0,85

Глицин

-

-

5,29±0,15

Сумма аминокислот

50,57±1,08

21,87±0,63

175,34±5,31

Как видно из данных таблицы, в экстракте №1 были обнаружены аргинин, пролин и треонин, суммарное содержание которых составило 50,57±1,08 мг/кг. В составе экстракта №2 идентифицированы аргинин, лейцин, метионин, валин, пролин, треонин, серин и α-аланин, концентрация которых оказалась равной 21,87±0,63 мг/кг. Наиболее широко представлен качественный состав экстракта №3 (рис.), содержащий незаменимые (лейцин, аргинин, метионин, валин, треонин) и заменимые (пролин, серин, аланин, глицин) аминокислоты. По количественному содержанию экстракт №3 (175,34±5,31 мг/кг) также преобладает над экстрактами №1 и №2, что свидетельствует о большей степени извлекаемости аминокислот из растительного сырья с повышением температуры и давления в процессе сверхкритической углекислотной экстракции.

Рисунок. Электрофореграмма аминокислотного состава флюидного экстракта №3

Заключение

В результате проведенных исследований установлено наличие аминокислот в сверхкритических углекислотных экстрактах №1, №2 и №3 из семян чернушки посевной. Сравнительный анализ аминокислотных составов во флюидных экстрактах чернушки посевной позволили дифференцировать их по степени насыщенности гидрофильными соединениями – аминокислотами. Наиболее богатым по составу аминокислот оказался экстракт №3, при получении которого использовались высокие значения давления и температуры, в отличие от других получаемых экстрактов. Таким образом, регулируя отдельные параметры (температуру и давление) при производстве фитоэкстрактов из чернушки посевной методом сверхкритической углекислотной экстракции можно получать готовый продукт, содержащий комплекс гидрофобных (жирные кислоты и компоненты эфирного масла) и гидрофильных БАВ, в частности, аминокислот.

Рецензенты:

Дроздова И.Л., д.фарм.н., декан фармацевтического и биотехнологического факультетов, профессор кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Курск.

Коновалов Д.А., д.фарм.н., заведующий кафедрой фармакогнозии пятигорского филиала ГБОУ ВПО Волгоградского государственного медицинского университета Минздрава России, г. Пятигорск.