Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

USE OF RECOMBINANT ERITROPOIETIN AND RESVERATROL FOR PHAFMACOLOGICAL CORRECTION OF MYOCARDIAL ISHEMIC INJURIES

Danilenko L.M. 1
1 «Belgorod National Research University»
In this paper we present experimental evaluation of the use of recombinant eritropoietin and resveratrol while simulating myocardial infarction. It was perceived that inserting of recombinant eritropoietin and resveratrol considerably lowered the expansion of necrotic myocardial zone in the left ventricle of heart up to 13,2±0,3 % and 15,2±0,8 relatively (in comparison with a control group of animals). While this figure was 27,3±1,2 % in a control group. Preparatory blockade of ATP-sensitive potassium channels with glibenclamide, nonselective blockade of NO-synthase with L-NAME and selective blockade of inducible NO-synthase with aminoguanidine neutralized the effects of recombinant erythropoietin and resveratrol, thus showing the protective effect of recombinant erythropoietin. The protective effect of recombinant erythropoietin and resveratrol is due to the activation of nitric oxide synthesis and by the ATP-sensitive potassium channels, which proves the realization of their effects by mechanisms which is similar to the mechanism of the effects of distant ischemic preconditioning.
distant ischemic preconditioning.
resveratrol
recombinant erythropoietin

Введение. Согласно современным представлениям, эндогенный кардиопротективный ответ, проявляющийся в росте устойчивости миокарда к ишемии-реперфузии, может быть индуцирован с помощью некоторых неишемических стимулов, не требующих инвазивного вмешательства. Данное направление находится в стадии интенсивной разработки и может включать использование некоторых фармакологических препаратов, имитирующих эффекты прекондиционирования [3], и физических факторов, активирующих определенные звенья внутриклеточных сигнальных систем, ответственных за увеличение устойчивости миокарда к ишемии-реперфузии [2]. В фармакологическом аспекте одним из наиболее перспективных гуморальных агентов, принимающих участие в реализации феномена прекондиционирования, является эритропоэтин. В свою очередь ресвератрол, природный фитоэстроген, наряду с антиоксидантной, гиполипидемической, антиагрегантной, эндотелиопротекторной активностью обладает также и кардиопротекцией [9]. Одним из обсуждаемых механизмов кардиопротекции резвератрола является прекондиционирование. Периоды полувыведений у эритропоэтина и резвератрола значительно выше, чем у других, в том числе и гуморальных агентов прекондициония (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, «временное терапевтическое окно» должно быть существенно шире.

Эритропоэтин (ЕРО) - индуцибeльный гипоксией гормон, который является существенным для нормального эритропоэза в костном мозге. Введение рекомбинантного эритопоэтина - эффективный и безопасный терапевтический подход к лечению анемии, связанной с хронической почечной недостаточностью [1]. Однако рецепторы EPO также широко распространены в сердечно-сосудистой системе, включая эндотелиальные, гладкомышечные и другие типы клеток. Одним из плеотропных эффектов ЭПО и его аналогов рекомбинантного эритропоэтина (РЭПО) является уменьшение апоптоза. Известно, что три важных фактора (рецептор аденозина А1, комплексные киназы, в том числе протеинкиназа С (РКС), митоген активируемая протеинкиназа (МАРК) и тирозинкиназы) и каналы калия, чувствительные к митохондрическому АТФ (КАТФ), играют наиболее важную роль в опосредованной прекондиционированием кардиозащите. Другие эффекторы, скорее всего способствующие кардиопротекции посредством аденозина или прекондиционирования (которое вовлечено в процесс замедленного (второго) этапа кардиозащиты) включают в себя МАРК, белки теплового шока, а также iNOS и eNOS. Материалы и методы. Изучение влияния рекомбинантного эритропоэтина (50 МЕ/кг) и ресвератрола (2 мг/кг) на размер зоны некроза при инфаркте миокарда проводили на модели коронароокклюзионного инфаркта миокарда у кроликов. При этом инфаркт миокарда воспроизводился на наркотизированных животных (хлоралгидрат 300 мг/кг), находящихся на управляемом дыхании, путем перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка левого предсердия, с последующей регистрацией ЭКГ во II стандартном отведении в течение 20 минут. Эритропоэтин и ресвератрол вводили животным за 30 минут до перевязки коронарной артерии в маргинальную вену уха кролика. Через 30 минут после коронарной окклюзии осуществляли снятие лигатуры и проведение реперфузии миокарда в течение 90 мин. После этого осуществляли забор крови из правого желудочка сердца в одноразовую вакуумную пробирку с антикоагулянтом для определения специфического маркера повреждения кардиомиоцитов Troponin I (TnI). Уровень TnI определяли на иммунофлуоресцентном приборе Triage MeterPro (Biosite, США) с использованием тест-системы Cardiac Panel. Срезы миокарда помещали в емкости, содержащие фосфатный буфер (рН 7,4) и 1 мг/мл трифенилтетразолия хлорид. Соотношение масс участков ткани и буфера составляло 1:9. Бюксы помещали в термостат, инкубировали при 37˚С для образования красного формазана. Подсчет площадей интактного и некротизированного миокарда левого желудочка производили на каждом из четырех произведенных срезов с помощью попиксельного анализа в программе Adobe Photoshop 9.0. Данные по размерам площади инфаркта представляли в виде отношения некротизиро-ванного миокарда к интактному (в процентах). Дистантное ишемическое преконди-ционирование осуществляли путем наложения жгута на верхнюю треть бедра на 10 минут, с последующей 20-минутной реперфузией. Контролем правильности наложения жгута служило отсутствие пульса на артериях голени. С целью подтверждения гипотезы о реализации эффектов ресвератрола и рекомбинантного эритропоэтина по типу ишемического прекондиционирования кроликам за полчаса до введения исследуемых препаратов вводили L-NAME в дозе 25 мг/кг/сут (блокатор эндотелиальной е-NOS синтазы), аминогуанидин в дозе 100 мг/кг (блокатор индуцибельной iNOS синтазы), глибенкламид в дозе 0,4 мг/кг (блокатор АТФ-зависимых калиевых каналов).

Результаты исследования и их обсуждение. Наложение лигатуры на нисходящую ветвь левой коронарной артерии в контрольной группе приводило к развитию некроза миокарда левого желудочка, размер которого составил 27,3±1,2 %. Применение ДИП, фармакологического прекондиционирования путем в/в введения эритропоэтина и внутрибрюшинного ресвератрола привело к достоверному уменьшению площади некротизированного миокарда и составило 9,4±0,5 %, 13,2±0,3 % 15,2±0,8 % соответственно. Блокада еNOS и iNOS на фоне моделирования инфаркта миокарда, применения эритропоэтина и ресвератрола, ДИП привела к нивелированию противоишемических эффектов. Величина зоны некроза в группе животных, получавших L-NAME и эритро-поэтин, составила 23,5±1,2 %, у ресвератрола 24,1±1,3 %, получавших L-NAME и ДИП - 25,3±0,8 %, аминогуанидин и эритропоэтин - 28,6±2,9 %, аминогуанидин и ресвератрол - 26,6±1,9 %, аминогуанидин и ДИП - 22,8±2,0 %. При блокаде АТФ-зависимых калиевых каналов величина зоны некроза в группе животных, получавших глибенкламид и эритропоэтин, - 21,2±1,1 %, ресвератрол - 28,5±1,3 %, глибенкламид и ДИП - 24,2±1,5 %. Уровень тропонина, как и предполагалось, изменяется с размером площади некроза миокарда левого желудочка (табл. 1).

Таблица 1

Влияние блокады NO-синтазы и АТФ-зависимых калиевых каналов на эффекты рекомбинантного эритропоэтина, ресвератрола, дистантного прекондиционирования и уровень тропонина I при моделировании коронароокклюзионного инфаркта миокарда (M±m, n=6)

Группа

% некроза

Уровень тропонина I, нг/мл

Контроль (инфаркта миокарда )

27,3±1,2

16,26±1,9

ИМ + дистантное прекондиционирование

9,4±0,5*

4,9±1,3*

ИМ + эритропоэтин(50 МЕ)

13,2±0,3*

5,0±1,9*

ИМ+ резвератрол (2 мг/ кг)

15,2±0,8*

5,24±1,1*

ИМ + L-NAME + дистантное прекондиционирование

23,5±1,2

14,15±1,2

ИМ + L-NAME + эритропоэтин

25,3±0,8

16,05±1,9

ИМ + L-NAME + резвератрол

24,1±1,3

17,11±1,2

ИМ + глибенкламид + дистантное прекондиционирование

24,2±1,5

16,34±1,8

ИМ + глибенкламид + эритропоэтин

21,2±1,1

15,45±1,2

ИМ + глибенкламид + резвератрол

28,5±1,3

16,95±1,8

ИМ + аминогуанидин + дистантное прекондиционирование

22,8±2,0

14,11±1,2

ИМ + аминогуанидин + эритропоэтин

28,6±2,9

17,55±1,7

ИМ + аминогуанидин + резвератрол

26,6±1,9

15,45±1,2

Примечание: * - р≤0,05 при сравнении с контрольной группой.

Исходя из результатов экпериментов, дистантное ишемическое прекондиционирование, рекомбинантноый эритропоэтин и ресвератрол обладают в равной степени выраженным кардиопротекторным действием.

Кратковременная ишемия миокарда инициирует каскад определенных биохимических процессов в кардиомиоцитах. Эти процессы направлены на защиту миокарда от повреждений, связанных с его ишемизацией. Благодаря этому короткому, но эффективному «курсу закаливания» миокард становится подготовленным к последующей ишемии, в связи с чем он гораздо более успешно защищается от агрессивных факторов, обусловленных ухудшением питания и оксигенации сердца. Этот физиологический феномен, названный «ишемическим прекондиционированием», был открыт не так давно, но уже привлек к себе внимание множества ученых. В случае острой ишемии этот механизм может предотвратить развитие инфаркта миокарда, а если последний все же происходит, ишемическое прекондиционирование обеспечивает меньшие размеры инфаркта, уменьшает вероятность появления аритмии, предохраняет от значительных нарушений функций миокарда левого желудочка, а также уменьшает повреждения миокарда, связанные с реперфузией. Одним из препаратов, который возможно использовать для проведения фармакологического прекондиционирования, может явиться рекомбинантный эритропоэтин. Перспективы применения эритропоэтина в клинике объясняются его плеотропными эффектами. Во многих исследованиях было показано протективное действие ЭПО на ишемию-реперфузию в различных органах и тканях, включая головной мозг [10], спинной мозг, почки [7], сердце [8]. В частности, доказан независимый кардиопротективный эффект ЭПО, снижение зоны инфаркта миокарда и улучшение функции сердца при ишемии-реперфузии вне зависимости от изменения гемоглобина, числа эритроцитов и напряжения кислорода в крови. В ряде исследований показано, что снижение апоптоза - один из возможных главных механизмов защитного эффекта ЭПО [8]. К механизмам реализации кардиопротективного действия ресвератрола [6] можно отнести: антиоксидантный, противовоспалительный, повышающий активность ферментов NOS, стимулирующих ангиогенез. Но один из самым обсуждаемых механизмов - это эффект, опосредованный через прекондиционирование. Каким образом ишемия может сыграть прекондиционирующее, то есть «подготавливающее», действие? Во время кратковременного ишемического эпизода кардиомиоциты начинают выделять аденозин и брадикинин, что, в свою очередь, вызывает активацию универсального внутриклеточного мессенджера - протеинкиназы С. Под ее действием АТФ-зависимые калиевые каналы гладкомышечных клеток сосудов и кардиомиоцитов, закрытые в норме, открываются. За счет этого происходит защитное укорочение сердечных потенциалов действия. Такой эффект имеет энергосберегающее значение, и при возникновении в ближайшее время повторной ишемии миокарда отмечается снижение его метаболической активности, уменьшение скорости распада АТФ, замедление гликогенолиза и снижение скорости нарастания внутриклеточного ацидоза. Благодаря всему этому миокард лучше переносит ишемию, в том числе более длительную и выраженную.

Как видно из нашего исследования, АТФ-зависимые калиевые каналы являются важным эффекторным звеном в реализации цитопротекторного действия как дистантного прекондиционирования, так и рекомбинантного эритропоэтина и ресвератрола. Оксид азота играет важную роль в реализации кардиопротекторных эффектов рекомбинантного эритропоэтина и ресвератрола. И в том и другом случае синтез его осуществляется за счет активации индуцибельной N0-синтазы, однако в механизме цитопротекции большое значение имеет эндотелиальная N0-синтаза, выполняющая, по всей вероятности, триггерную роль. Доказанная способность эритропоэтина и ресвератрола активировать протеинкиназы [5] позволяет предположить их триггерную роль в процессе реализации эффектов фармакологического прекондиционирования. Вышеизложенное подтверждает наше предположение о том, что эритропоэтин и ресвератрол являются триггерами ишемического прекондиционирования и могут вызывать фармакологическое прекондиционирование, а реализация естественных механизмов защиты от ишемии осуществляется за счет активации АТФ-зависимых калиевых каналов и биосинтеза оксида азота, фармакологических миметиков прекондиционирования, индуцирующих воспроизводимый и стабильный кардиопротективный ответ и в то же время лишенных серьезных побочных эффектов. Выводы

1. Проведение дистантного ишемического прекондиционирования, введение рекомбинантного эритропоэтина и ресвератрола достоверно, относительно контрольной группы животных, уменьшало распространенность зоны некроза миокарда левого желудочка.

2. АТФ-зависимые калиевые каналы являются эффекторным звеном в механизме цитопротекторного действия как дистантного ишемического прекондиционирования, так и рекомбинантного эритропоэтина и ресвератрола на модели коронарооклюзионного инфаркта миокарда.

3. Блокада эндотелиальной и индуцибельной NO-синтазы нивелирует цитопротекторный эффект рекомбинантного эритропоэтина и ресвератрола на модели коронарооклюзионного инфаркта миокарда, что доказывает роль оксида азота в реализации эффектов прекондиционирования.

Рецензенты:

Тохтарь В.К., д.б.н., профессор кафедры фармацевтической технологии медицинского института НИУ «БелГУ», г. Белгород.

Голивец Т.П., д.м.н., профессор кафедры терапии факультета последипломного медицинского образования медицинского института НИУ «БелГУ», г. Белгород.